Untersuchungen zur Abhängigkeit von MyD88 und TNF

Zunächst sollte die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass die TRIM30-Induktion nach LTβR-Aktivierung indirekt über den LTβR stattfindet, indem TNF und/oder IL-1 induziert werden, die letztlich für die TRIM30-Expression verantwortlich sind. Dazu erfolgten Untersuchungen mit BMDM aus TNF- und MyD88-defizienten Mäusen, die freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von V. Todorov (Institut für Physiologie, Universität Regensburg) sowie E. Gäbele (Gastroenterologie und Hepatologie, Universitätsklinikum Regensburg) zur Verfügung gestellt wurden. MyD88 stellt das intrazelluläre Adapterprotein im TLR/IL-1R-abhängigen NFκB-Aktivierungsweg dar, das in beiden Signalwegen eine Schlüsselrolle einnimmt. Mit Ausnahme von TLR3 wird MyD88 von allen TLRs rekrutiert, wobei TLR4, 5 und 9 exklusiv über dieses Adapterprotein signalisieren. Für TLR4 bestehen nach LPS-Stimulierung zwei Möglichkeiten: entweder über einen abhängigen Weg mit nachfolgender schneller oder über einen MyD88-unabhängigen Weg mit konsekutiv langsamer Aktivierung von NFκB (Kawai et al., 2007).

4.9.1.1 LTβR-Expression auf MyD88^-/-- und TNF^-/--BMDM

Die BMDM wurden nach bestehendem Protokoll aus MyD88^-/-- und TNF^-/--Mäusen differenziert und auf die Expression des LTβR mittels Durchflusszytometrie untersucht. Beide defizienten Mauslinien zeigten wie die WT-Tiere eine Expression des LTβR auf ihrer Oberfläche (Abb. 47).

4 Ergebnisse 105

Abb. 47: Durchflusszytometrischer Nachweis der Expression des LTβR auf CD11b⁺ F4/80⁺ MyD88^-/-- und TNF^-/--BMDM. BMDM wurden mit CD11b und F4/80 sowie anti-Maus LTβR mAK gefärbt. Anschließend erfolgte die Analyse im Durchflusszytometer. Gezeigt ist die Expression des LTβR auf lebenden F4/80⁺ CD11b⁺ Zellen in einem Histogramm. Die Abbildung ist repräsentativ für zwei voneinander unabhängige Experimente.

4.9.1.2 LTβR-abhängige TRIM30-Expression in MyD88^-/-- und TNF^-/--BMDM

Die TRIM30-Expression in BMDM aus MyD88^-/-- und TNF^-/--Mäusen wurde nach Stimulierung mit agonistischem anti-Maus LTβR mAK für 16 h auf transkriptioneller Ebene untersucht. Als Kontrolle erfolgte eine Behandlung mit LPS. Zusätzlich wurden die MyD88^-/- -BMDM mit Poly (I:C) stimuliert. Anschließend wurde eine qPCR für TRIM30 durchgeführt.

Wie in Abb. 48A+B zu sehen ist, konnte die Expression von TRIM30-mRNA in BMDM aus beiden defizienten Mauslinien in gleichem Maße wie in WT-BMDM nach LTβR-Stimulierung induziert werden. Die LTβR-Stimulierung mit LPS führte in TNF^-/--BMDM ebenfalls zum Anstieg der TRIM30-Expression. Im Vergleich zu WT-BMDM zeigten die MyD88^-/- -BMDM jedoch eine verminderte Transkription der TRIM30-mRNA nach LPS-Behandlung, während die TRIM30-Induktion nach Stimulierung mit Poly (I:C) unbeeinflusst blieb, da die TRIM30-Expression im TLR4-Signalweg abhängig und im TLR3-Signalweg unabhängig von MyD88 vermittelt wird. Eine LTβR-Voraktivierung führte in diesen BMDM ebenfalls zu einer Reduktion der TLR-induzierten TNF- und IL-6-Freisetzung (Daten nicht gezeigt).

Damit ist davon auszugehen, dass die Induktion von TRIM30 nach LTβR-Aktivierung unabhängig von MyD88 oder TNF vermittelt wird.

LTβR

% of Max

LTβR

% of Max

Isotypkontrolle

BMDM WT + anti-LTβR mAK BMDM MyD88^-/-+ anti-LTβR mAK BMDM TNF^-/-+ anti-LTβR mAK Isotypkontrolle

BMDM WT + anti-LTβR mAK BMDM MyD88^-/-+ anti-LTβR mAK BMDM TNF^-/-+ anti-LTβR mAK

Abb. 48: Relative Expression von TRIM30 in BMDM aus TNF^-/-- und MyD88^-/--Mäusen nach LTβR-Aktivierung. BMDM aus (A) WT- und MyD88^-/--Mäusen sowie (B) WT- und TNF^-/-- Mäusen wurden unbehandelt belassen, mit 10 µg/ml rat IgG, 10 µg/ml agonistischem anti-Maus LTβR mAK für 16 h sowie 100 ng/ml LPS oder 25 µg/ml Poly (I:C) für 8 h stimuliert. Anschließend wurde die Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und die Expression von TRIM30-mRNA in der qPCR bestimmt. Angegeben sind die Mittelwerte der Triplikate ± SD. Die Daten sind repräsentativ für drei voneinander unabhängig durchgeführte Experimente.

4.9.2 NFκB-Aktivierung in BMDM und J774-Zellen

Im Folgenden sollte überprüft werden, welcher NFκB-Signalweg nach der Stimulierung des LTβR für die Regulation der Expression von TRIM30 verantwortlich ist. Es ist bekannt, dass die Stimulierung des LTβR sowohl zur Aktivierung des klassischen NFκB-Signalwegs als auch zur Aktivierung des alternativen NFκB-Signalwegs führen kann (Hehlgans et al., 2005).

Zunächst wurde untersucht, welcher der beiden möglichen NFκB-Signalwege nach der Aktivierung des LTβR in BMDM und J774-Zellen induziert wird.

WT-BMDM sowie J774-Zellen wurden mit 10 µg/ml anti-Maus LTβR mAK für 2 h, 6 h oder 16 h stimuliert oder unstimuliert belassen. Anschließend wurden die nukleären Extrakte dieser

0

4 Ergebnisse 107 Zellen in einem ELISA-basierenden DNA-Bindungsassay, einem NFκB-ELISA, eingesetzt (siehe 3.3.10.1). Untersucht wurde dabei die Aktivierung von RelA (klassischer Signalweg) und die Aktivierung von RelB (alternativer Signalweg), die sich in einer vorangegangenen Arbeit als gute Indikatoren für die Aktivierung des entsprechenden NFκB-Wegs herausstellten (Dissertation Daller, 2008).

BMDM

Nach der Stimulierung des LTβR konnten die beiden NFκB-Proteine RelA und RelB im Zellkern der BMDM nachgewiesen werden, so dass die Aktivierung des LTβR zur Induktion sowohl des klassischen als auch des alternativen NFκB-Wegs in diesen Zellen führte. Der Zeitverlauf der Aktivierung war für beide NFκB-Signalwege sehr ähnlich. 2 h nach der Stimulierung der Zellen nahm die Konzentration von RelA und RelB im Zellkern stark zu und verringerte sich nach 6 h bzw. 16 h wieder, wobei sie in dieser Zeit annähernd gleich blieb (Abb. 49A+B).

Abb. 49: Die Aktivierung des klassischen und des alternativen NFκB-Signalwegs in BMDM. Die aus WT-Mäusen stammenden BMDM wurden für 2 h, 6 h und 16 h mit 10 µg/ml agonistischem anti-Maus LTβR mAK stimuliert oder unbehandelt belassen. Die nukleären Zellextrakte wurden anschließend in einem NFκB-ELISA untersucht. In (A) ist die Aktivierung von RelA und in (B) die Aktivierung von RelB gezeigt. Exemplarisch ist jeweils eins von drei unabhängigen Experimenten dargestellt.

J774-Zellen

Die Stimulierung des LTβR führte auch in J774-Makrophagen zur Aktivierung beider NFκB-Signalwege. Der zeitliche Verlauf der Aktivierung von beiden Transkriptionsfaktoren unterschied sich in J774-Zellen jedoch von der in BMDM beobachteten Kinetik. Die Konzentration von RelA und RelB stieg 2 h nach der Behandlung mit agonistischem anti-Maus LTβR mAK im Zellkern leicht an und erhöhte sich nach 6 h stärker. Die Menge an

0,9

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelB

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelB

unst. anti-LTβR mAK 2 h 6 h 16 h 16 h

B)

RelA fiel nach 16 h deutlich auf etwa das Niveau ab, das nach 2 h erreicht war. Die Konzentration von RelB blieb hingegen nach 16 h weiterhin erhöht (Abb. 50A+B).

Abb. 50: Die Aktivierung des klassischen und des alternativen NFκB-Signalwegs in J774-Zellen. Die Zellen wurden für 2 h, 6 h und 16 h mit 10 µg/ml agonistischem anti-Maus LTβR mAK stimuliert oder unbehandelt belassen. Die nukleären Zellextrakte wurden anschließend in einem NFκB-ELISA untersucht. In (A) ist die Aktivierung von RelA und in (B) die Aktivierung von RelB gezeigt. Exemplarisch ist jeweils eins von drei unabhängigen Experimenten dargestellt.