Identifizierung der TNFR-associated factor-Proteine (TRAF)

Neben dem Transkriptionsfaktor NFκB sind die Moleküle der TRAF-Familie im intrazellulären Signalweg der LTβR-Aktivierung von besonderer Bedeutung. Bisher wurde gezeigt, dass der LTβR die TRAF-Proteine 2, 3 und 5 binden kann, während TRAF6 nicht mit dem LTβR interagiert (Chang et al., 2002). TRAF6 ist das wichtige Signalmolekül im TLR/IL-1R-Signalweg. Um festzustellen, über welches Adapterprotein die LTβR-abhängige TRIM30-Expression induziert wird, wurde der Effekt einer dominant-negativen TRAF2-, TRAF3-, TRAF5- und TRAF6-Mutante auf diesen Signalweg untersucht. Diesen Mutanten fehlt die sogenannte RING-Finger-Domäne. Die Deletion des RING-Fingers resultiert in einer dominant-negativen Mutante, die zwar noch mit allen bekannten TRAF-Bindemolekülen interagieren kann, jedoch keine Signale mehr weiterleitet (Inoue et al., 2000). Die J774-Zellen wurden mit der dominant-negativen Form von TRAF2, TRAF3 TRAF5 und TRAF6 retroviral transduziert. Als Kontrolle diente der pQXIP-Leervektor.

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unst. rIgG anti-LTβR

mAK

unst. rIgG anti-LTβR

mAK

4 Ergebnisse 113 4.9.4.1 LTβR-Expression auf transduzierten J774 TRAF DN

Um auszuschließen, dass die Expression des LTβR auf den transduzierten Zellen beeinträchtigt ist, wurden diese wie bereits unter Punkt 4.2.2 beschrieben durchflusszytometrisch auf die Expression des LTβR hin untersucht.

Abb. 54: Durchflusszytometrischer Nachweis der Expression des LTβR auf J774 TRAF-Mutanten. Die J774 WT, EGFP, TRAF2 DN, TRAF3 DN, TRAF5 DN und TRAF6 DN wurden mit anti-Maus LTβR mAK gefärbt. Anschließend erfolgte die Analyse im Durchflusszytometer. Gezeigt ist die Expression des LTβR auf lebenden Zellen in einem Histogramm. Die Abbildung ist repräsentativ für drei voneinander unabhängige Experimente.

Wie Abb. 54 zeigt, hatte die Transduktion mit den TRAF-Mutanten keine Auswirkungen auf die LTβR-Expression der J774-Zellen.

4.9.4.2 LTβR-abhängige TRIM30-Expression in transduzierten J774 TRAF DN

Zur Untersuchung der TRIM30-Expression nach LTβR-Aktivierung wurden die mit EGFP, TRAF2, 3, 5 und 6 DN transduzierten J774-Zellen für 16 h mit 10 µg/ml rat IgG, 10 µg/ml agonistischem anti-Maus LTβR mAK stimuliert oder unbehandelt belassen. Die TRAF-Proteine sind in verschiedene Signalwege involviert, so dass die transduzierten Zellen zur Positivkontrolle zusätzlich mit unterschiedlichen Agenzien stimuliert wurden. Die J774 TRAF2 DN und TRAF5 DN wurden mit 50 ng/ml TNF stimuliert, da diese Proteine die NFκB-Aktivierung im TNFR1- und TNFR2-Signalweg vermitteln können. TRAF3 besitzt im TLR3-Signalweg eine zentrale Bedeutung, so dass die Zellen mit 25 µg/ml Poly (I:C) stimuliert wurden. Da TRAF6 ein wichtiges Adaptermolekül im Signalweg der

TLR/IL-1R-LTβR

% of Max

LTβR

% of Max

Isotypkontrolle

J774 WT + anti-LTβR mAK J774 EGFP + anti-LTβR mAK J774 TRAF2 DN + anti-LTβR mAK J774 TRAF3 DN + anti-LTβR mAK J774 TRAF5 DN + anti-LTβR mAK J774 TRAF6 DN + anti-LTβR mAK Isotypkontrolle

J774 WT + anti-LTβR mAK J774 EGFP + anti-LTβR mAK J774 TRAF2 DN + anti-LTβR mAK J774 TRAF3 DN + anti-LTβR mAK J774 TRAF5 DN + anti-LTβR mAK J774 TRAF6 DN + anti-LTβR mAK

Superfamilie ist, wurden die J774 TRAF6 DN mit 100 ng/ml LPS stimuliert. Die TRIM30-Expression in den transduzierten Zellen wurde mittels qPCR analysiert.

In der nachfolgenden Abbildung sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengefasst (Abb. 55).

Abb. 55: Analyse der Expression von TRIM30 in J774 TRAF-Mutanten nach LTβR-Aktivierung. Die J774 (A) TRAF2 DN, (B) TRAF3 DN, (C) TRAF5 DN und (D) TRAF6 DN wurden mit 10 µg/ml rat IgG, 10 µg/ml agonistischem anti-Maus LTβR mAK für 16 h sowie 100 ng/ml LPS, 50 ng/ml TNF oder 25 µg/ml Poly (I:C) für 8 h stimuliert. Die Gesamt-RNA wurde isoliert und revers transkribiert. Anschließend erfolgte der Nachweis der TRIM30-mRNA mittels quantitativer PCR. Angegeben sind die Mittelwerte der Triplikate ± SD. Die Daten sind repräsentativ für mehr als drei voneinander unabhängig durchgeführte Experimente.

Die Stimulierung des LTβR mit agonistischem Antikörper führte in den J774-Zellen, die mit TRAF2, TRAF5 und TRAF6 DN transduziert waren, zu einer Induktion der Expression von TRIM30-mRNA wie in den Kontrollzellen, so dass eine Beteiligung dieser Adapterproteine im LTβR-abhängigen TRIM30-Signalweg ausgeschlossen werden kann. Wie zu erwarten, zeigten diese Zellen nach TNF- bzw. LPS-Stimulierung im Vergleich zu J774 EGFP eine verringerte TRIM30-Expression auf transkriptioneller Ebene, da TRAF2 bzw. TRAF5 im TNFR-Signalweg und TRAF6 im TLR4-Signalweg entscheidend beteiligt sind (Abb.

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4 Ergebnisse 115 55A+C+D). In den J774 TRAF3 DN konnte die TRIM30-mRNA-Expression in Abhängigkeit der LTβR-Aktivierung hingegen nicht induziert werden. Auch die Stimulierung mit Poly (I:C) hatte keinen Anstieg der TRIM30-Expression zur Folge, da TRAF3 im TLR3-Signalweg involviert ist (Abb. 55B). Damit scheint die LTβR-vermittelte Induktion von TRIM30 in J774-Zellen abhängig von TRAF3 zu sein.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Induktion von TRIM30 nach Aktivierung des LTβR vom klassischen NFκB-Signalweg abhängig zu sein scheint. Zudem kann davon ausgegangen werden, dass TRAF3 eine zentrale Rolle in der Regulation der LTβR-abhängigen TRIM30-Expression spielt.

5 Diskussion

Eine gut abgestimmte Entzündungsantwort ist notwendig für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und die Bekämpfung von Krankheiten. Wird die Immunantwort aber nicht richtig reguliert, kann sie zur Gefahr für den Organismus werden. Unkontrollierte Entzündungsreaktionen können zur extensiven Gewebsschädigungen und zur Manifestation entzündlicher Erkrankungen führen (Foster et al., 2009). Über die Rolle des LTβR in der Entzündungsreaktion ist bis jetzt nur wenig bekannt. Entgegen der Meinungen, dass LTα ein proinflammatorisches Zytokin ist und dessen Neutralisierung zur Verminderung der Entzündungsreaktion führt, konnte erstmals in Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die Hemmung der LTβR-Aktivierung zur Verschlimmerung der Entzündung im experimentellen Modell der akuten DSS-induzierten Kolitis führt (Jungbeck et al., 2008). Die zugrundeliegenden zellulären und molekularen Mechanismen sind jedoch unklar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig die Effektormechanismen, die zu einer Regulation der Entzündungsreaktion nach LTβR-Aktivierung führen, speziell auf Makrophagen näher untersucht.