Identifizierung des NFκB-Signalwegs

Wie schon erwähnt, wird die TLR-induzierte TRIM30-Expression über den klassischen NFκB-abhängigen Signalweg kontrolliert (Shi et al., 2008). Um festzustellen, welcher der beiden NFκB-Signalwege bei der Induktion der TRIM30-Expression nach LTβR-Stimulierung involviert ist, wurden die einzelnen Signalwege durch Transduktion mit spezifischen Inhibitoren in J774-Zellen gehemmt. Der entscheidende Schritt bei der Aktivierung des klassischen NFκB-Signalwegs ist die Degradation des Inhibitors IκBα, welcher die Translokation des NFκB-Dimers (RelA/p50) in den Zellkern ermöglicht. Zur Hemmung des klassischen Signalwegs wurde eine mutierte Form von IκBα verwendet, deren Aminosäuren S32 und S36, an denen die Phosphorylierung stattfindet, durch Alanine ausgetauscht sind (Iimuro et al., 1998), so dass der Abbau von IκBα nicht mehr stattfinden kann und die Induktion des klassischen Wegs blockiert ist. Der alternative Signalweg, welcher auf der Phosphorylierung von IKKα-Homodimeren durch die NFκB-induzierende Kinase (NIK) beruht, wird durch die dominant-negative Form von NIK gehemmt, bei der die beiden Lysine K429 und K430 jeweils durch ein Alanin ersetzt sind (Holtmann et al., 1999).

Dadurch wird die Phosphorylierung und folglich die Aktivierung von NIK verhindert und der

0

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelB

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelB

unst. anti-LTβR mAK 2 h 6 h 16 h 16 h

B)

4 Ergebnisse 109 alternative Weg ist blockiert. Die J774-Zellen wurden retroviral mit diesen Mutanten (pQXIP-IκBα SR und pQXIP-NIK DN) transduziert, um eine stabile Expression zu erreichen. Als Negativkontrolle erfolgte eine Transduktion mit dem Plasmid pQXIP-EGFP. Diese Zellen wurden für alle folgenden Versuche als Kontrollzellen verwendet.

4.9.3.1 LTβR-Expression auf transduzierten J774 IκBα SR und J774 NIK DN

Durch die retrovirale Transduktion der J774-Zellen mit den mutierten Formen von IκBα und NIK könnte die Expression des LTβR beeinflusst werden. Um dies auszuschließen, wurden die transduzierten J774-Zellen durchflusszytometrisch auf die Expression des LTβR hin überprüft.

Das Ergebnis ist in Abb. 51 in Form eines Histogramms dargestellt. Es konnten keine Unterschiede in der LTβR-Expression auf der Oberfläche der mit EGFP, NIK DN und IκBα SR transduzierten J774-Zellen im Vergleich zu den WT-Zellen festgestellt werden.

Abb. 51: Durchflusszytometrischer Nachweis der Expression des LTβR auf J774 EGFP, NIK DN und IκBα SR. Die Zellen wurden mit anti-Maus LTβR mAK gefärbt. Anschließend erfolgte die Analyse im Durchflusszytometer. Gezeigt ist die Expression des LTβR auf lebenden Zellen in einem Histogramm. Die Abbildung ist repräsentativ für drei voneinander unabhängige Experimente.

LTβR

% of Max

LTβR

% of Max

Isotypkontrolle

J774 WT + anti-LTβR mAK J774 EGFP + anti-LTβR mAK J774 NIK DN + anti-LTβR mAK J774 IκBαSR + anti-LTβR mAK Isotypkontrolle

J774 WT + anti-LTβR mAK J774 EGFP + anti-LTβR mAK J774 NIK DN + anti-LTβR mAK J774 IκBαSR + anti-LTβR mAK

4.9.3.2 NFκB-Aktivierung in transduzierten J774 IκBα SR und J774 NIK DN

Für die Bestimmung der NFκB-Aktivierung in den mit NIK DN und IκBα SR transduzierten J774 sowie in den Kontrollzellen wurde wie in 4.9.2 beschrieben vorgegangen. Da NIK eine zentrale Rolle im alternativen NFκB-Signalweg spielt, sollte die Rekrutierung von RelA in den transduzierten J774 NIK DN wie in den Kontrollzellen verlaufen, während die Aktivierung von RelB beeinträchtigt sein müsste. In den IκBα SR-Zellen sollte nur der klassische Weg blockiert sein und RelB normal aktiviert werden können.

Die Konzentration von RelA im Zellkern der NIK-Mutante ist über den gesamten Stimulationszeitraum im Vergleich zu den Kontrollzellen leicht verringert. Während nach 2 h und 16 h keine Zunahme zu beobachten war, stieg die Menge an RelA nach 6 h aber noch deutlich an. Es ist davon auszugehen, dass der klassische Weg leicht beeinflusst wird. Die Rekrutierung von RelA in den Zellkern der J774-Zellen, die mit dem IκBα SR tranduziert wurden, war im Vergleich zu den Kontrollzellen und zu den J774 NIK DN-Zellen am stärksten verringert. Bei diesen Zellen scheint somit die Induktion des klassischen NFκB-Wegs gehemmt zu sein (Abb. 52A). In den J774 NIK DN liegen die Werte für RelB deutlich unter denen der Kontrolle, so dass hier der alternative Weg stark beeinträchtigt zu sein scheint. Die Aktivierung von RelB in den J774 IκBα SR blieb hingegen annähernd unbeeinflusst und lag auf dem Niveau der Kontrollzellen (Abb. 52B).

0

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

relative Aktivierung von RelA

unst. anti-LTβR mAK

4 Ergebnisse 111

Abb. 52: Aktivierung des klassischen und des alternativen NFκB-Signalwegs in J774 EGFP, NIK DN und IκBα SR. Die Zellen wurden für 2 h, 6 h und 16 h mit agonistischem anti-Maus LTβR mAK stimuliert oder unbehandelt belassen. Die nukleären Zellextrakte wurden anschließend in einem NFκB-ELISA untersucht. In (A) ist die Aktivierung von RelA und in (B) die Aktivierung von RelB gezeigt. Exemplarisch ist jeweils eins von drei unabhängigen Experimenten dargestellt.

4.9.3.3 LTβR-abhängige TRIM30-Expression in transduzierten J774 IκBα SR und J774 NIK DN

Die transduzierten J774 EGFP-, IκBα SR- und NIK DN-Zellen wurden im Weiteren nach Aktivierung des LTβR auf die Expression von TRIM30 mittels qPCR untersucht.

Die Hemmung des alternativen NFκB-Signalwegs scheint keinen Einfluss auf die TRIM30-Expression nach LTβR-Stimulierung zu haben, da in J774 NIK DN-Zellen eine Induktion der TRIM30-mRNA-Expression nachzuweisen war. Mit der Blockierung des klassischen NFκB-Signalwegs mittels IκBα SR konnte dagegen die LTβR-abhängige Induktion der TRIM30-Transkription in J774-Zellen gehemmt werden. Die Stimulierung dieser Zellen mit LPS führte wie erwartet ebenfalls zur Reduktion der Expression von TRIM30 auf transkriptioneller Ebene, da bekannterweise die TLR-vermittelte TRIM30-Induktion über den klassischen NFκB-Signalweg vermittelt wird (Shi et al., 2008). Die Transduktion mit der mutierten Form von NIK hatte keine Auswirkungen auf die TRIM30-Expression nach LPS-Behandlung (Abb.

53). Aufgrund dieser Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass die LTβR-vermittelte Induktion von TRIM30 vom klassischen NFκB-Signalweg abhängig ist.

0 0,5 1 1,5 2 2,5

relative Aktivierung von RelB

unst. anti-LTβR mAK

2 h 6 h 16 h

16 h B)

0 0,5 1 1,5 2 2,5

relative Aktivierung von RelB

unst. anti-LTβR mAK

2 h 6 h 16 h

16 h B)

J774 EGFP J774 NIK DN J774 IκBαSR J774 EGFP J774 NIK DN J774 IκBαSR

Abb. 53: Analyse der Expression von TRIM30 in J774 EGFP, NIK DN und IκBα SR nach LTβR-Aktivierung. Die transduzierten J774-Zellen wurden unbehandelt, mit 10 µg/ml rat IgG, 10 µg/ml agonistischem anti-Maus-LTβR mAK für 16 h oder 100 ng/ml LPS für 8 h stimuliert. Die Gesamt-RNA wurde isoliert und revers transkribiert. Anschließend erfolgte der Nachweis der TRIM30-mRNA mittels quantitativer PCR. Angegeben sind die Mittelwerte der Triplikate ± SD. Die Daten sind repräsentativ für drei voneinander unabhängig durchgeführte Experimente.