Untersuchung von Leptin, Insulin und Glukose im Blut

2.3.2.1 Versuchstiere

Der Versuch wurde an 9 männlichen Ziegen der Rasse Deutsche Edelziege durchgeführt. Zum Versuchszeitpunkt waren die Tiere 10 – 12 Monate alt, und waren im Alter von 2 – 4 Monaten kastriert worden. Aufgrund großer Heterogenität der Tiergewichte (29 – 49 kg Körpergewicht) wurden die Tiere in vier Gewichtsgruppen eingeteilt. Um mögliche Einflüsse der Gewichte auf die Ergebnisse der Untersuchung zu minimieren, wurden die Tiere aus jeder Gewichtsgruppe gleichmäßig auf die beiden Behandlungsgruppen verteilt. Die Versuchsdurchführung wurde, als genehmigungspflichtiger Tierversuch, von der Bezirksregierung Köln bestätigt (Aktenzeichen 50.203.2-BN 13, 19/03).

2.3.2.2 Euthanasie und Entnahme der Gewebeproben

Hauptziel dieser Arbeit ist die Darstellung und der Vergleich der mRNA-Expression ausgewählter Proteine, die in der Regulation des Leptinsystems, des Glukose- und des Fettsäurenstoffwechsel relevant sein könnten. Es wurden Proben von Leber und Skelett- oder quergestreifter Muskulatur (kurz: Muskel), sowie retroperitoneales Fettgewebe (kurz: Organfett) aus dem Nierenbereich und Unterhautfettgewebe entnommen, da diese Gewebe für die Regulation dieser Stoffwechselwege von großer Bedeutung sind (CHILLIARD et al., 2001; CHELIKANI et al., 2003a).

Unmittelbar nach Entnahme der letzen Blutprobe wurde das Tier durch die intravenöse Applikation von Pentobarbital^® (0,2 ml/kg Körpergewicht, Essex Tierarznei, Essex Pharma, München, Deutschland) euthanasiert (WANG et al., 1998). Der Ablauf der Probenentnahme entsprach immer demselben Muster, und wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Haut des gesamten Tierkörpers wurde an der rechten Seite, von der Linea alba ausgehend, abgelöst. Zuerst wurde eine Probe des M. semitendinosus entnommen, und anschließend das subkutane Fett der rechten Körperseite gewonnen. Danach erfolgte die Öffnung der Bauchhöhle entlang des Rippenbogens, zur Entnahme einer Probe des rechten Leberlappens distal der Gallenblase. Zuletzt wurden das Unterhautfett der linken Körperseite und das Nierenkapselfett reseziert.

Die Gewebe wurden sofort in eisgekühlter steriler Kochsalzlösung gespült. Muskel und Leber wurde direkt in Trockeneis gefroren, das Fettgewebe wurde zuvor in flüssigem Stickstoff schockgefroren, und dann in Trockeneis gelegt. Gelagert wurden die Proben bei –80° C. Die Probennahme war spätestens 1,5 Stunden nach Tötung des Tieres abgeschlossen.

2.3.2.3 Infusionslösungen

Die Propionatlösung wurde nach einem modifizierten Protokoll in Anlehnung an die Arbeiten von LEE u. HOSSNER (2002) und JANES et al. (1985) hergestellt. Die Mengen wurden für die Infusionsdauer von 260 min berechnet. Die Infusion setzte sich aus den Komponenten Propionsäure (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Natriumhydroxid (NaOH, Roth, Karlsruhe), Kaliumchlorid (KCl, Roth, Karlsruhe), Reinstwasser (s. Anhang) und tiereigenem Serum (s. 2.1.2) zusammen, mit einer Propionatkonzentration von 1,2 M. Zur Herstellung wurde Propionsäure (100 %) mit Reinstwasser verdünnt. Anschließend wurde der pH-Wert mittels pH-Meter (Orion, ORI037002, pH/mV/ISE/Temp Meter, Colora, Lorch) kontrolliert, und unter Zugabe der NaOH - Plätzchen auf pH 7,4 eingestellt. Weiter wurde Kalium (1,2 mg·100 ml^-1) zugegeben. Nach Sterilisierung im Autoklaven (Systec-Tischautoklav, 2540 EL, Tuttnauer, Breda, Niederlande) wurde der pH-Wert erneut überprüft und bei Bedarf korrigiert. Das Kalium diente dazu, einer Hypokaliämie (RABINOWITZ et al., 1984) während der Behandlung vorzubeugen. Unmittelbar vor der Applikation wurde das tiereigene Serum (0,6 ml·100 ml^-1) zur zusätzlichen Pufferung des eingestellten pH-Wertes zugefügt.

Die Zusammensetzung der Negativkontrolle wurde entsprechend der Propionatlösung konzipiert. Aufgrund der osmotischen Aktivität von Natriumionen und dessen Bedeutung im Organismus, wurde als Negativkontrolle eine Lösung mit derselben Natriumkonzentration hergestellt. Auf Grundlage der zugegebenen Menge an NaOH wurde dafür die Natriumkonzentration der Propionatlösung berechnet. Die enthaltene Menge Natrium entsprach einer 1,15 M Lösung. Wegen der einfachen Verfügbarkeit und aufgrund des physiologischen Vorkommens, wurden die Natriumionen als Kochsalz (NaCl, Roth, Karlsruhe) eingesetzt. Gemäß dem Herstellungsprotokoll wurde Kaliumchlorid zugegeben, autoklaviert, und das tiereigene Serum für die gebrauchsfertige Lösung zugemischt.

2.3.2.4 Versuchsaufbau und Blutentnahmen

Um die Anzahl der Versuchstiere gering zu halten, wurden Vorversuche durchgeführt, in denen die Konzentration und Dauer der Infusionen optimiert wurde.

Die Behandlungsprotokolle wurden dabei ohne Gewebeentnahme durchgeführt. Fünf dieser Versuche mit entsprechender Konzentration wurden in die statistische Auswertung aufgenommen. Diese unterschieden sich allerdings in Dauer (Infusionsdauer 255 min, Gesamtdauer 315 min) und Probennahmefrequenz (15minütig). Die Versuchsdauer im Hauptversuch betrug 320 min (Infusionsdauer 260 min). Die Tiere wurden unmittelbar am Ende der Infusion getötet, und Gewebeproben für die molekularbiologische Untersuchung entnommen (2.3.1). Eine 60-minütige Vorperiode vor jeder Infusion diente der Ermittlung der Basalwerte, und die Infusion startete unmittelbar im Anschluss.

Die Probennahmefrequenz unterschied sich zwischen den Versuchen und den beiden Tiergruppen. Bei den mit Propionat behandelten Tieren wurden durchschnittlich 1,0 ml Blut in Intervallen von fünf Minuten entnommen. Um die Belastung niedrig zu halten wurde bei den Tieren mit Kochsalzinfusion in zehnminütigen Abständen entnommen. Glukose wurde in allen Blutproben gemessen, so dass in beiden Versuchsabschnitten für die Propionatgruppe alle fünf Minuten, in der Kontrollgruppe alle zehn Minuten ein Wert ermittelt wurde.

Leptin und Insulin wurde in der Propionatgruppe in den Vorversuchen in fünfzehnminütigen Abständen, im Hauptversuch in zehnminütigen Abständen gemessen, während in der Behandlungsgruppe alle zehn Minuten ermittelt wurde.

Das Serumprofil der freien Fettsäuren wurde durch hochfrequente Probenuntersuchung zum Versuchsbeginn, beim Infusionsstart und am Versuchsende charakterisiert. Zwischen der 60. – 210. Minute, wurde in sechzigminütigen Abständen beprobt.

Die Infusionsgeschwindigkeit berechnet sich aus der Konzentration der Lösungen und der Infusionsrate für Propionat von 96 µmol·kg^-1·min^-1. Die NaCl-Kontrolle wurde entsprechend dem Körpergewicht mit einer äquivalenten Na-Konzentration und Infusionsgeschwindigkeit appliziert.

In die Auswertung der Blutparameter wurden die fünf Infusionen der Vorversuche, und neun des Hauptversuches einbezogen. Bei einem Tier wurde dieselbe Infusion zweimal durchgeführt. Diese wurde über gemittelte Werte nur einmal in die Auswertung miteinbezogen. Für die Blutparameter ergaben sich somit

Gruppengrößen von n=8 in der Propionatgruppe, und n=5 in der Kontrollgruppe. Für die molekularbiologischen Analysen betrug die Gruppengröße für Propionat n=4, und n=5 für die Kontrolle.

2.3.2.5 Statistische Auswertung

Für die statistische Auswertung kam das Statistikprogramm SAS^® System 8e (SAS Institute, Massachusettes, USA) zur Anwendung. Die Berechnung erfolgte mit dem Algorithmus „Mixed Procedure“, um Veränderungen der Blutspiegel unter Berücksichtigung der fixen Effekte Zeit, Behandlung und der Interaktionen Zeit x Behandlung über den Versuchszeitraum zu untersuchen. Dabei werden sowohl Effekte der Behandlung auf die Gruppen im gesamten Betrachtungszeitraum als auch Einflüsse des Zeitverlaufs auf alle Tiere berücksichtigt. Die Probenfrequenz wurde bei der statistischen Untersuchung mit dem mixed model (repeated measurement) berücksichtigt.

Zudem können mögliche Effekte der Behandlung auf den zeitlichen Verlauf innerhalb und zwischen den Gruppen anhand der Betrachtung von Einzelmessungen ermittelt werden. Ein weiterer Vorteil diese Methode ist, dass sie die unterschiedliche Anzahl von Messungen je Zeitpunkt berücksichtigt. Diese Voraussetzung ist aufgrund der unterschiedlichen Probenintervalle bei den Versuchsgruppen und in den Versuchsperioden notwendig (vgl. 2.3.2.4). Die Auswertung erfolgte nach Ermittlung der Covarianzstruktur anhand des AIC (Akaike`s Information Criterion).

2.4 Untersuchung von Plasmaleptingehalt und