Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Institut für Tierwissenschaften, Abteilung Physiologie und Hygiene Universität Bonn
Untersuchungen zur energetischen Regulation des Leptinsystems bei der Ziege
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von CHRISTOPH SEYBOLD
aus Heilbronn
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Herr Prof. Dr. Gerhard Breves Frau Prof. Dr. Dr. Helga Sauerwein
1. Gutachter: Herr Prof. Dr. G. Breves 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. M. Ganter
Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2008
Diese Arbeit wurde durch die H. Wilhelm Schaumann Stiftung finanziell unterstützt.
Für meine Familie.
Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 2005 in Stuttgart-Hohenheim (Vortrag und Poster), der 16. Tagung der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft 2006 in Gießen (Vortrag und Abstrakt), der 8th European Congress of Endocrinology 2006 in Glasgow (Großbritannien, Poster und Abstrakt), in Journal of Animal Science 84, Suppl. 1/
Journal of Dairy Science 89, Suppl. 1: 348 (2006, Volltext und Abstrakt) und in Journal of Livestock Science, doi:10.1016/j.livsci.2008.02.001 (2008, Volltext und Abstrakt) veröffentlicht.
1 Einleitung und Literaturübersicht 1
2 Material und Methoden 16
2.1 Versuchstiere 16
2.1.1 Haltung und Fütterung 16
2.1.2 Versuchsablauf 16
2.1.3 Tierschutz, Tierbetreuung und Belastungsbeurteilung 17 2.2 Bestimmung von Metaboliten und Hormone im Blut 18
2.2.1 Glukose 18
2.2.2 Serumgewinnung 18
2.2.3 Leptin 18
2.2.4 Insulin 19
2.2.5 Freie Fettsäuren 19
2.3 Effekte einer Propionatinfusion auf das periphere Leptin- system und Parameter des Glukosestoffwechsels bei der
Ziege 20
2.3.1 Entwicklung von real-time RT-PCR Assays für Leptin (ob), die lange Form des Leptinrezeptors (ob-Rb), den G-proteingekoppelten
Rezeptor 41 (GPR41) und die 18S rRNA 20
2.3.1.1 Mengenbestimmung und Kontrolle der RNA 20
2.3.1.2 Reverse Transkription (RT) 23
2.3.1.3 Zielgene und interne Kontrolle für die PCR 24
2.3.1.4 Real-time RT-PCR 27
2.3.1.5 Statistische Auswertung 33
2.3.2 Untersuchung von Leptin, Insulin und Glukose im Blut 34
2.3.2.1 Versuchstiere 34
2.3.2.2 Euthanasie und Entnahme der Gewebeproben 34
2.3.2.3 Infusionslösungen 35
2.3.2.4 Versuchsaufbau und Blutentnahmen 36
2.3.2.5 Statistische Auswertung 37
2.4 Untersuchung von Plasmaleptingehalt und Glukosestoff-
wechsel bei Ziegen peri partum 37
2.4.1 Versuchstiere 37
2.4.2 Hyperglykämischer Clamp und Euglykämisch/hyperinsulinämischer
Clamp 38
2.4.3 Messgrößen 40
2.4.4 Vergleichsgrößen der Clampstudien 41
2.4.5 Erfassung der Milchmenge und Laktosekonzentration 41
2.4.6 Statistische Auswertung 42
3 Ergebnisse 43
3.1 Effekte intravenöser Propionatinfusionen auf verschiedene
Zielparameter 43
3.1.1 Beeinflussung der mRNA-Mengen in verschiedenen Geweben 43
3.1.1.1 Qualität der Gesamt-RNA 43
3.1.1.2 cDNA-Sequenz der langen Form des Leptinrezeptor und
putativen G-proteingekoppelten Rezeptor bei der Ziege 43 3.1.1.3 Gelelektrophorese der real-time PCR-Amplifikate 44
3.1.1.4 Ergebnisse der mRNA-Quantifizierung 48
3.1.1.4.1 Unterschiede der mRNA-Mengen in den Fettgeweben 48
3.1.1.4.2 Leptin 49
3.1.1.4.3 Lange Form des Leptinrezeptors 49
3.1.1.4.4 Putativer G-proteingekoppelter Rezeptor GPR41 49 3.1.2 Veränderungen spezifischer Blutparameter durch intravenöse
Propionatinfusion 51
3.1.2.1 Leptin 51
3.1.2.2 Insulin 51
3.1.2.3 Glukose 52
3.1.2.4 Freie Fettsäuren 52
3.2 Veränderungen im Glukosestoffwechsel bei trächtigen und bei
laktierenden Ziegen 54
3.2.1 Hyperglykämischer Clamp 54
3.2.2 Euglykämisch/hyperinsulinämischer Clamp 55
3.2.3 Leptin 56
3.2.4 Freie Fettsäuren 59
3.2.5 Einflüsse der Glukose- und Insulininfusion auf die Milchleistung 60
4 Diskussion 62
4.1 Quantifizierende real-time RT-PCR 62
4.2 Veränderungen durch Propionatinfusion und deren Einfluss auf die Genexpression der untersuchten mRNA-Spezies 69
4.3 Veränderungen von Leptin und Insulin, sowie Einflüsse der
Galaktopoese bei der Ziege peri partum 82
5 Zusammenfassung 91
6 Summary 93
7 Literaturverzeichnis 95
8 Tabellenverzeichnis 113
9 Abbildungsverzeichnis 114
10 Anhang 115
Abkürzungsverzeichnis
ad lib. ad libitum
ADP Adenosindiphosphat Aq. bidest. Aqua bidestillata ATP Adenosintriphosphat BCS Body conditioning score
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
cDNA komplementäre DNA
CoA Coenzym A
CT Threshold cycle
CV Variationskoeffizient DEPC Diethylpyrocarbonat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EST Expressed sequence tags FFA Free fatty acid
GAPDH Glyceraldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase GIR Glukoseinfusionsrate
GDP Guanosindiphosphat GLM General linear model GLUT Glukosetransporter GTC Guanidinthiocyanat GTP Guanosintriphosphat
HBW Hexosaminbiosyntheseweg
HHG Haushaltsgene
JAK Januskinase
IRS Insulin-Rezeptorsubstrat LCFA Long-chained fatty acids
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MCR Metabolic clearance rate of insulin MOPS 3-N-Morphlino-Propansulfonsäure
mRNA Messenger RNA
n Anzahl der Tiere
NEFA Non-esterified fatty acid NSP Nutrient-sensing pathway r Korrelationskoeffizient
rRNA Ribosomale RNA
RT-PCR Reverse transcription PCR PCR Polymerase chain reaction
qPCR Quantitative PCR
SCFA Short-chained fatty acid
SDR Systemic delivery rate of insulin SEM Standard Error of Means
SGLT Sodium Glucose Cotransporter
STAT Signal transducer and activator of transcription TGF-ß Transforming growth factor ß
TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin TNFα Tumor Nekrose Faktor
TS Trockensubstanz
1 Einleitung und Literaturübersicht
Die Tierhaltung in der modernen Landwirtschaft steht großen Herausforderungen gegenüber. Einerseits steigen die Anforderungen an Umwelt- und Tierschutz, andererseits erfordert ein zunehmender Preis- und Konkurrenzdruck höhere Produktionsleistungen. Um diesen Entwicklungen nachzukommen, und gleichzeitig eine gute Tiergesundheit zu gewährleisten ist die Erforschung und das Wissen über die genauen Zusammenhänge der Stoffwechselphysiologie und ihrer Regulation wichtig.
Die Leistungen der Nutztiere werden durch die Parameter Wachstum, Laktation und Reproduktion beschrieben, einhergehend mit hohen Stoffwechselraten der Tiere.
Voraussetzung dafür ist eine ausreichende Energieversorgung. Sie ist nicht nur für die Aufrechterhaltung der Stoffwechselvorgänge bedeutsam, sondern ist auch direkt mit der Tiergesundheit verbunden.
Eine mangelnde Versorgung resultiert nicht nur in verminderter Leistung, sondern birgt auch gesundheitliche Risiken für den betroffenen Bestand. Energiedefizite treten insbesondere bei hochleistenden Tieren auf (FUHRMANN et al., 1989). Bei der Milcherzeugung, aber auch für die Reproduktion, ist dabei gerade der Zeitraum um die Geburt eine besonders kritische Zeit in der Versorgung des Organismus (DRACKLEY, 1999). Namentlich stellt das Fettmobilisationssyndrom der Milchkuh ein Problem in der Milchviehwirtschaft dar, denn damit sind weitere Erkrankungen, wie Endometritis, Mastitis oder Dislocatio abomasi verbunden (CAMERON et al., 1998; DRACKLEY, 1999). Auch bei anderen landwirtschaftlichen Nutztieren sind peripartale Stoffwechselerkrankungen bekannt, wie die Trächtigkeitstoxikose bei Schaf und Ziege (BOSTEDT u. DEDIE, 1996).
Der Organismus ermöglicht einerseits die metabolische Anpassung des Organismus an verschiedene Belastungszustände (z.B. Nahrungsmangel), und andererseits gleichzeitig die Aufrechterhaltung der lebens- bzw. arterhaltenden Funktionen (Reproduktion, Gravidität, Laktation, Wachstum). Diese homöorhetische Regulation wird durch ein fein abgestimmtes Regelwerk von Faktoren und Hormonen ermöglicht. Dabei wird die Nährstoffversorgung des Gewebes gewährleistet, das für die jeweilige Stoffwechselleistung im Vordergrund steht („Nutrient partitioning“). Eine hervorgehobene Bedeutung wird dabei dem Hormon Leptin zugeschrieben (zur Übersicht: VERNON u. POND, 1997; INGVARTSEN u. BOISCLAIR, 2001).
Hauptsyntheseort für Leptin ist bei monogastrischen und ruminierenden Spezies das weiße Fettgewebe (zur Übersicht: FRIEDMAN und HALAAS, 1998; CHILLIARD et al., 2001; DELAVAUD et al., 2002). Das Fettgewebe synthetisiert zudem eine Reihe von Hormonen, Vorläufern, Gewebshormonen und Zytokinen, wie z.B. Adiponektin, Angiotensinogen, Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß) und Tumor Nekrose Faktor α (TNFα). Neben seiner Funktion als Energiespeicher, auf den im Bedarfsfall zurückgegriffen wird, wirkt es als endokrines Organ in vielfältiger Weise auf den Energiestoffwechsel und die Körperfunktionen.
Leptin (griech. leptos = schlank) ist ein niedermolekulares Protein und besteht aus 167 Aminosäuren. Am N-terminalen Ende trägt es eine Signalsequenz aus 21 Aminosäuren, welches bei der Translokation in Mikrosomen und anschließender Exozytose entfernt wird. Das zirkulierende Peptid hat eine Größe von 146 Aminsäuren mit einer molekularen Masse von 14–16 kDa. Aufgrund von Strukturähnlichkeiten wird es der Familie der Zytokine zugerechnet. Leptin ist das Produkt des ob-Gens, (ob für griech. obesitas = Fettleibigkeit), welches 1994 von ZHANG et al. sequenziert wurde. Das zirkulierende Hormon wird durch ein spezifisches Bindungsprotein reguliert. Bei Ratten liegt 88% des zirkulierenden Leptins frei, und bei Menschen 24% in gebundener Form vor. Die Halbwertszeit des Proteins beim Menschen liegt im Durchschnitt bei 25 Minuten. Bei Nagern verlängert sich durch die Bindung die Halbwertszeit von 3,4 min auf 71 Minuten. (GARCIA et al., 2002; MAČAJOVA et al., 2004; LIEFERS et al., 2005; ZIEBA et al., 2005).
Die Expression von Leptin in verschiedenen Fettdepots differiert zwischen den Tierarten. CHELIKANI et al. (2003a) wiesen Leptin-mRNA bei Rindern in subkutanem, perikardialem, perirenalem und mesenterialem Fettgewebe nach.
Konzentrationsunterschiede zwischen den Depots bestanden dabei nicht. Dies bestätigt die Untersuchungen nach JI et al. (1998), die ebenfalls beim Rind keine Unterschiede zwischen Unterhautfett, omentalem und perirenalem Fettgewebe nachweisen konnten. Nach KIM et al. (2000) ist jedoch die Expression in perirenalem Fett höher gegenüber anderen Fettdepots. Hingegen wurde bei Schafen eine tendenziell höhere, und bei Ziegen signifikant höhere mRNA-Menge im subkutanen Fettgewebe gegenüber perirenalem Fettgewebe gezeigt (KUMAR et al., 1998;
CHILLIARD et al., 2001). Angaben über die Expression im mesenterialen Fettgewebe machen die Autoren nicht. Leptin-mRNA wurde außerdem in
Eutergewebe, Skelettmuskulatur, Plazenta, Magen-/ Pansenschleimhaut, braunem Fettgewebe und Gehirn nachgewiesen (CHILLIARD et al., 2001; BARTHA et al., 2005).
Die Hormonaktivität von Leptin wird durch membranständige Rezeptoren vermittelt.
Diese werden durch das db-Gen codiert. Man unterscheidet mindestens sechs Isoformen, deren mRNAs durch alternatives Splicing entstehen. Die extrazelluläre Domäne ist bei allen identisch. Sie unterscheiden sich durch ihre Transmembran- und intrazelluläre Domäne, und werden als Splice-Varianten a bis f des Ob-R bezeichnet (FRUHBECK, 2006).
Durch Bindung von Leptin kommt es zur Rezeptordimerisierung. Im intrazellulären Bereich binden Abschnitte des Rezeptors an Janus-aktivierte Proteinkinasen (JAK).
Diese werden durch Bindung eines Dimers aktiviert. Die JAK wiederum aktiviert den Signaltransduktions- und Transkriptions (STAT)-Mechanismus, der die Expression von Genen steuert. Ein weiterer Weg der Signaltransduktion ist die Aktivierung der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) durch die JAK (HOUSEKNECHT u.
PORTOCARRERO, 1998; ZABEAU et al., 2003).
Der Ob-Rb ist durch eine lange intrazelluläre Domäne charakterisiert, und wird deshalb auch als die lange Form des Leptinrezeptors bezeichnet. Synonym werden die Bezeichnungen, ob-Rl und LR geführt. Er wird bei Rind und Monogastriern in einer Vielzahl von Geweben nachgewiesen. Beim Rind wird ob Rb unter anderem im weißen Fettgewebe, in Skelettmuskulatur, Leber, Milz, Hoden, Hypophyse, Blutgefäßen und Lunge, sowie im Euterparenchym beobachtet. Der ob-Rb aktiviert den JAK-STAT und MAPK-Mechanismus. Aufgrund seines Vorkommens in vielen Geweben ist der ob-Rb somit bestimmend für die Aktivität von Leptin in der Körperperipherie (zur Übersicht: TARTAGLIA, 1997; INGVARTSEN u. BOISCLAIR, 2001; ZABEAU et al., 2003; FRUHBECK, 2006).
Die Splice-Variante Ob-Ra wird bei der Ratte im Hypothalamus und Hypophysenvorderlappen, sowie in geringen Mengen in Lunge, Niere, Pankreas, Leber und Fettgewebe gebildet (LOLLMANN et al., 1997). Nach CHELIKANI et al.
(2003a) wird ob-Ra beim Rind in der Hypophyse, Leber, Milz, Nebennierenrinde und Hirnstamm exprimiert. YONEKURA et al. (2003) zeigten in boviner Hypophysen- zellkultur, dass die Ob-Ra-Expression durch die Gabe von Butyrat gesenkt wird. Dies
spricht für eine Rolle des Rezeptors bei der zentralnervösen Steuerung der Energiehomöostase.
Der Ob-Re wird auch als sekretorischer Leptinrezeptor bezeichnet. Seine Expression steht im Zusammenhang mit Körpermasse, Trächtigkeit und Energieaufnahme. Dem Ob-Re wird die Rolle als Bindungsprotein für freies Leptin im Blutplasma zugeschrieben. Beim Menschen konnte dadurch eine Bedeutung bei der Regulation der Leptinwirkung und Leptinsensitivität gezeigt werden (GAVRILOVA et al., 1997;
LEWANDOWSKI et al., 1999; YANNAKOULIA et al., 2003, YANG et al., 2004). Für die kurzen Formen Ob-Rc, d und f ist keine Funktion bekannt.
Die allgemeinen Funktionen und Wirkungen von Leptin werden im Folgenden skizziert. Leptin ist an der Regulation der Energiehomöostase, Steuerung der Reproduktion, und der kardiovaskulären Entwicklung (z.B. Wundheilung), sowie der renalen Funktion und der Immunantwort beteiligt (FRUHBECK, 2006). Die primäre Wirkung des Leptins liegt in der Regulation der Nahrungsaufnahme und Energiehomöostase. Diese wird hauptsächlich zentralnervös über das Hypothalamus-Hypophysensystem vermittelt. Im Hypothalamus wird die Ausschüttung orexigener Neuropeptide vermindert, und die der anorexigenen erhöht.
Gleichzeitig beeinflusst es Wachstum, Stoffwechsel und Fortpflanzung, indem verschiedene hypothalamische Hormone moduliert werden.
Dabei wird Leptin durch einen negativen Feed-back-Mechanismus reguliert. Seine Wirkung wird wiederum über diese erhöhten und erniedrigten Plasmaleptinspiegel gesteuert. Diese Verhältnisse sind sowohl in Monogastriern, als auch bei Wiederkäuern zu finden (zur Übersicht: INGVARTSEN und BOISCLAIR, 2001).
Für Leptin sind sowohl endokrine, als auch parakrine und autokrine Wirkungen und Regulation beschrieben (WANG et al., 1999a; CHILLIARD et al., 2001). Bei Wiederkäuern wird Leptin unabhängig von Tagesrhythmus sezerniert.
(INGVARTSEN u. BOISCLAIR, 2001; ZIEBA et al., 2005).
Beim Rind konnte nachgewiesen werden, dass Polymorphismen des Leptingens in Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit und Leistungsparametern bei den Fleisch- und Milchrinderrassen stehen, insbesondere mit der Milchmenge, Energieverteilung und postpartalen Gelbkörperaktivität (LIEFERS et al., 2005).
DELAVAUD et al. (2002) beschreiben, dass bei Wiederkäuern der Plasmaleptingehalt durch mehrwöchige Futterrestriktion gesenkt wurde, der nach
Anfüttern in einigen Tagen wieder anstieg. Der Plasmaleptingehalt war dabei positiv mit der Fettzellgröße und dem Body-conditioning-score (BCS) korreliert. Schon bei geringer Futterrestriktion kam es jedoch zum Rückgang des Plasmaleptinspiegels, ohne eine Änderung der Fettzellgröße oder des BCS herbeizuführen. Die Nahrungsaufnahme führte bei gut genährten Rindern zu einem Abfall sowohl des Plasmaleptin-, als auch des Glukosespiegels. Bei schlecht genährten Tieren kam es dagegen zu einem Anstieg von Plasmaleptin, und einem Erhalt der Blutglukosekonzentration. Die Konzentration an ß-Hydroxybutyrat und der Plasmaleptinspiegel nach Nahrungsaufnahme hingegen waren negativ korreliert.
Einen Zusammenhang zwischen dem präprandialen Plasmaleptinspiegel und ß- Hydroxybutyrat wiesen die Autoren nicht nach. Die Autoren vermuten, dass die postprandialen Veränderungen der Glukose- und ß-Hydroxybutyratkonzentrationen zu einer Veränderung der Glukoseaufnahme im Fettgewebe führen, die die Leptinkonzentration beeinflusst, und so mittelfristig regulierend auf die Leptinsekretion bei Wiederkäuern wirken.
Da bei Kühen mit geringem Körperfettanteil der niedrige Plasmaleptingehalt jedoch nicht durch Futterentzug beeinflusst wird, schlussfolgern DELAVAUD et al. (2002), dass langfristige Effekte von größerer Bedeutung in der Regulation sind, als mittelfristige.
Bei der energetischen Regulation konnten für dieses Hormon zudem vielfältige Effekte und Wechselwirkungen mit Hormonen und Metaboliten nachgewiesen werden. Aufgrund der Komplexität des Systems wird bei der Beschreibung vor allem auf jene Wirkungen eingegangen, die direkt mit dem Glukose- und Fettstoffwechsel im Zusammenhang stehen.
Von diesen direkten Wirkungen auf Zellen verschiedener Gewebe sind für die Regulation der Energiehomöostase die Wirkungen auf den Lipid- und Kohlenhydrat-, sowie den Intermediärstoffwechsel des Muskelgewebes von besonderem Interesse.
In einer Studie über die Effekte von Insulin und Leptin auf die Leptinsynthese in Skelettmuskelzellen von Ratten, stimulierte Leptin die Glukoseaufnahme, -oxidation und Glykogensynthese (CEDDIA et al. 1999). SWEENEY et al. (2001) konnten jedoch in der Myozytenzellkultur zeigen, daß Leptin keinen Einfluss auf die basale Glukoseaufnahme, sowie die GLUT4-Translokation (Glucosetransporter 4) ausübt, aber über verschiedene Wege den insulinabhängigen Glukosetransport senkt.
Infolgedessen scheint der Einfluss von Leptin auf den Glukosestoffwechsel indirekt über Insulin zu erfolgen.
Zusamenfassend scheint Leptin von grundsätzlicher Bedeutung für die Ausbildung einer verminderten systemischen Insulinsensitivität. Ein mögliches Schlüsselenzym bei der Ausbildung leptinassoziierter Insulinresistenz ist die Stearoyl-CoA Desaturase-1, die in der Leber durch Leptin gehemmt wird (COHEN et al., 2002;
COHEN u. FRIEDMAN, 2004).
Gleichzeitig führt Leptin zur Senkung des Plasmaspiegels von Insulin, der Triacyglyzeride (TAG) und Glukose, und einer Erhöhung des ß-Hydroxybutyrat- Spiegels. Bei Rindern wiederum wurde eine positive Wirkung des Plasmaleptins auf die Glykämie und eine negative Korrelation zu ß-Hydroxybutyrat im Plasma in Folge der Nahrungsaufnahme beobachtet (CHILLIARD et al., 2001).
WANG et al. (1999b) zeigten allerdings bei Ratten, dass Leptin die Glukoseverwertung im Muskel- und braunen Fettgewebe erhöht, im weißen Fettgewebe jedoch reduziert. Es bestehen somit gewebespezifische Unterschiede in der Beeinflussbarkeit durch Leptin, was einen Erklärungsansatz für die teilweise gegensätzlichen Wirkungen des Leptins im Energiestoffwechsel bildet. Diese Gewebespezifität weist auf die Bedeutung dieses Hormons bei der Steuerung des Nutrient partitioning. Freie Fettsäuren (FA) und Lipide im Blutplasma werden durch Leptin gesenkt, indem es in monogastrischen Muskel- und Leberzellen die FA- Oxidation erhöht und FA-Veresterung hemmt (SHIMABUKURO et al. 1997;
MINOKOSHI et al., 2002).
Bei trächtigen Ziegen wird durch exogene Leptingabe die Fettsäurenkonzentration im Blut gesenkt, und die Insulinsensitivität erhöht, während bei laktierenden Ziegen, die Fettsäuren unbeeinflusst bleiben, und die Insulinsensitivität reduziert wird (HEINTGES, 2003).
Die Mechanismen der gegenseitigen Beeinflussung von Leptin und Insulin sind noch nicht abschließend geklärt. Während HOUSEKNECHT et al. (2000) die Erhöhung der Leptin-mRNA in boviner Adipozytenkultur durch Insulin nachwiesen, zeigten RICCI et al. (2005), dass die insulininduzierte Leptinerhöhung in der Fettzellkultur von Ratten und Menschen nicht über die Genexpression, sondern durch posttranskriptionale Mechanismen reguliert wird.
Leptin ist mit Körperfettgehalt, Energiebalance und Höhe der Nahrungsaufnahme positiv korreliert (KUMAR et al., 1998; DELAVAUD et al., 2002; GEARY et al. 2003).
Der Einfluss von Adipositas auf den Plasmaleptingehalt wurde in den Studien von DELAVAUD et al. (2000 und 2002) und EHRHARDT et al. (2003) mit 17% bis 35%
angegeben. Allerdings zeigten EHRHARDT et al. (2003) bei nichtruminierenden Schaflämmern, die physiologisch mit sehr geringem Körperfettgehalt geboren werden, dass deren Plasmaleptinspiegel vom Ernährungsniveau dominiert wird.
Über die Regulationsmechanismen der Leptinsynthese in peripheren Geweben und physiologische Zusammenhänge auf zellulärer Ebene, ist beim Wiederkäuer noch wenig bekannt. Grundsätzlich kann der Plasmaleptinspiegel durch transkriptionale, posttranskriptionale und posttranslationale Mechanismen gesteuert werden (GARCIA et al., 2002; LIEFERS et al., 2005; RICCI et al., 2005). Neben hormonellen Mechanismen wurde zudem bei Rodentia auch eine Autoregulation durch negativen feed-back im Fettgewebe nachgewiesen, d.h. Plasmaleptin hemmt die Leptinexpression im Fettgewebe. Da es gleichzeitig die Expression im Skelettmuskel einleitet, wird dieser Regulationskreis als weiteren Einfluss auf das Nutrient partitioning angesehen (WANG et al., 1999a; CHILLIARD et al., 2001).
Von größerer Bedeutung für die Regulation der Leptinsynthese sind Nutrient sensing pathways (NSP). Beim Monogastrier konnte gezeigt werden, dass Glukose bedeutende Effekte auf die Regulation der Leptinsynthese hat (ZHANG et al., 2002).
Bei Mensch und Nagetieren wurde in vivo wie auch in vitro eine Erhöhung der Leptin- mRNA und des Proteins im Fettgewebe, sowie des Plasmaleptingehaltes, durch Infusion von Insulin und Glukose nachgewiesen (MALMSTROM et al., 1996;
MIZUNO et al., 1996; WANG et al., 1998). Auch durch eine übermäßige Zufuhr von freien Fettsäuren bzw. Glukose oder Glukosamin konnte die Leptinexpression gesteigert werden (EMILSSON et al., 2001; WANG et al., 1998).
Diese Stoffwechselwege beeinflussen direkt die Leptinsynthese, und bilden somit ein wichtiges Bindeglied zwischen Nahrungsangebot und –aufnahme, und hormoneller Steuerung des Energiestoffwechsels. Insbesondere wird der Erforschung von NSP im Zusammenhang mit der Entstehung von Diabetes Typ 2 Bedeutung beigemessen.
Ein bedeutender Pfad ist der Hexosaminbiosyntheseweg (WANG et al., 1998;
EMILSSON et al., 2001). Schlüsselenzym ist die GFAT (Glutamin:Fruktose-6- phosphat-Amidotransferase). Als Substrat wird Glukose durch Konjugation mit einer
Aminogruppe zu Glukosamin umgebildet. Dieses wird durch Konjugation mit Uridinphoshat zu einer aktivierten Verbindung. Durch Glykolysierung von Proteinen können diese reguliert werden. Die Relevanz als Nahrungssensor für Glukose ist nicht abschließend geklärt (BOSCH et al., 2003 und 2004). POUWELS et al. (2004) schreiben dem Hexosaminbiosyntheseweg beim Menschen eine Funktion als NSP für freie Fettsäuren im Fettgewebe zu.
Während jedoch beim Monogastrier ein Zusammenhang zwischen Leptin und der Entstehung von Insulinresistenz bekannt ist, gibt es für die Wiederkäuer bisher nur wenige Untersuchungen. Allgemein wird bei den Ruminantia der Blutglukosespiegel vornehmlich über das Verhältnis von Glucagon und Insulin und die hepatische Glukoneognense beeinflusst. Dem Insulin wird bei der Regulation der Steuerung der Glukoseversorgung nur eine untergeordnete Rolle zugeschrieben, wobei die Zellaufnahme von Glukose in der Körperperipherie grundsätzlich den gleichen Mechanismen unterliegt (SALLMANN u. FUHRMANN, 2000).
Bei Rindern stimuliert Leptin in einer mittleren Konzentration die Insulinsekretion, während bei hohen und niedrigen Konzentrationen nur geringe Veränderungen auftreten. ZIEBA et al. (2005) werten dies so, dass Leptin die Insulinsekretion normalisiert, und Entgleisungen der Insulinsynthese möglicherweise durch eine verminderte Leptinsensitivität ausgelöst sein können.
Bei Nagetieren und Menschen wurde schon frühzeitig nachgewiesen, dass eine supraphysiologische Hyperinsulinämie zu einer Erhöhung der Plasmaleptinkonzentration führt. Diese Effekte treten jedoch nach mehreren Stunden auf (4 Stunden) (UTRIAINEN et al., 1996). Der Einfluss von Glukose und Insulin auf die Leptinsekretion bei Wiederkäuern wurde von verschiedenen Autoren untersucht.
KAUTER et al. (2000) und GABAI et al. (2002) konnten durch Insulininfusion keine Erhöhung der Leptinsekretion nachweisen. LEURY et al. (2003) konnten nach 24 Stunden euglykämisch-hyperinsulinämischer Clamps eine Erhöhung des zirkulierenden Leptins nachweisen.
Bei verschiedenen Autoren ist der ältere Begriff der volatile (engl.) oder flüchtigen Fettsäuren (VFA) für Fettsäuren aus der Wiederkäuervormagenfermentation gebräuchlich. Zudem findet in der Literatur der Begriff NEFA für freie, nicht veresterte Fettsäuren Verwendung. In dieser Arbeit wird der Begriff der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) verwendet für Fettsäuren mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen (BREVES, 2000;
XIONG et al., 2004; COVINGTON et al., 2006). Fettsäuren in ungebundener Form mit mehr als 12 Kohlenstoffatomen werden als langkettige Fettsäuren (LCFA) bezeichnet. Aus Gründen der Genauigkeit ist allerdings in Zitaten die Begrifflichkeit der Autoren übernommen worden, und die Bezeichnungen werden dadurch teilweise synonym gebraucht.
Die Nährstoffversorgung der Wiederkäuer erfolgt über die SCFA aus der Vormagenfermentation. Hauptmetaboliten sind Azetat, Propionat und Butyrat, aber auch Valerat und dessen Derivate, die jedoch im Stoffwechsel eine untergeordnete Rolle spielen. Wenngleich Azetat prozentual überwiegt, ist besonders Propionat für die Energieversorgung wichtig. Die Glukosebereitstellung der Wiederkäuer ist vollständig von der hepatischen Glukoneogenese abhängig. Propionat dient als Substrat, welches, als Succinyl-CoA, über Oxalazetat der Glukoneogenese zugeführt wird und somit der Glukosebildung (glukoplastisch) dient. Wenngleich es Hinweise gibt, wonach auch Azetat zur Glukosebildung herangezogen wird, wird der überwiegende Anteil und Butyrat in den Mitochondrien als Acetyl-CoA im Citratzyklus metabolisiert (BREVES, 2000; SALLMANN u. FUHRMANN, 2000; KIM et al., 2005).
Die Anteile der unterschiedlichen SCFA aus der mikrobiellen Fermentation im Pansen unterliegen Schwankungen. Die Synthese ist vom Substrat abhängig und erfolgt über unterschiedliche Stoffwechselwege. Diese Schwankungen werden durch das Azetat-Propionat-Verhältnis charakterisiert. Raufaserreiches Futter führt zu einem Anstieg des Azetatanteiles, energiereiches oder fein gemahlenes Futter führt zu einem relativen Anstieg von Propionat (MENKE u. HUSS, 1987).
Propylenglykol (1,2-Propandiol) ist eine glukoplastische Verbindung, die zur Vorbeugung und Behandlung von Ketosen in der Frühlaktation bei Milchkühen eingesetzt werden kann. Die Ketose wird auf eine Hyperlipidämie in Folge von peripherer Insulinresistenz zurückgeführt. In ihren Untersuchungen beim Rind wiesen CHRISTENSEN et al. (1997) durch die Propylenglykolbehandlung einen Abfall von Azetat nach, und eine Erhöhung des Azetat-Propionat-Verhältnisses. Der Insulinspiegel wurde erhöht, und die NEFA-Konzentration (non-esterified fatty acids) fiel ab. KIM et al. (2005) untersuchten weiter Effekte von Propylenglykol auf die Leptinsynthese bei Rindern. Sie bestätigten die Untersuchungen von CHRISTENSEN et al. (1997), und wiesen zudem eine Erhöhung des Anteiles von Propionat im Pansen nach. Die Messung der Leptin-mRNA im Unterhautfett zeigte
keine Veränderungen. Allerdings führte die Behandlung zum Anstieg der Leptin- mRNA im intramuskulären Fettgewebe.
LEE u. HOSSNER (2002) zeigten einen Anstieg der Leptin-mRNA im Fettgewebe zwei Stunden nach Propionatinfusion. Die Autoren postulieren, dass dieser nicht allein durch die Insulinwirkung zu erklären ist. In der Hypophysenzellkultur und in Adipozytenkultur des Rindes konnte ebenfalls eine Erhöhung der Leptin-mRNA durch kurzkettige Fettsäuren gezeigt werden. Demgegenüber senken LCFA die Leptin-mRNA Konzentration (YONEKURA et al., 2003; SOLIMAN et al., 2007).
Allerdings bestreiten BRADFORD et al. (2006) eine bedeutende Rolle von Propionat für die Leptinexpression. Intravenöse Bolusinfusion von Propionat hatte einen Abfall der Plasmaleptinkonzentration zu Folge. Die intraruminale Infusion von Propionat führte zu keiner relevanten Erhöhung der Plasmaleptinkonzentration.
Weitere Erklärungsansätze für die Zusammenhänge zwischen Energie-, Insulin- und Leptinstoffwechsel ergaben sich aus der Erforschung der Signalwege verschiedener Rezeptoren. Dabei rückten insbesondere Rezeptoren aus der Superfamilie der G- proteingekoppelten Rezeptoren (GPR) in den Blickpunkt.
Von den verschiedenen Familien ist die große Gruppe der heterotrimeren G-Proteine in die Regulation verschiedenster Stoffwechselvorgänge eingebunden, und verfügt über eine dementsprechende Vielzahl von Liganden, und bildet therapeutisch bedeutsame, pharmakologische Angriffspunkte. Beispielhaft sei an dieser Stelle auf die muskarinergen und adrenergen Rezeptoren des vegetativen Nervensystems verwiesen.
Alle heterotrimeren GPR bestehen aus drei Untereinheiten (α,β und γ), und sind in der Zellmembran lokalisiert. Die Rezeptoren sind schleifenförmig aufgebaut, mit einem extrazellulären N-Terminus und intrazellulären C-Terminus. Dazwischen liegen 7 Transmembrandomänen. Die Bindung eines Liganden führt zur Konformationsänderung des Rezeptors. Über die darauffolgende Assoziation und Dissoziation der α-Untereinheit und den Austausch von GDP (Guanosindiphosphat) durch GTP (Guanosintriphosphat), wird die α-Untereinheit aktiviert. Dieser Komplex reguliert in der Signalkaskade, unter Abspaltung von Phosphat, weitere Enzyme, wie die Phospholipasen A und C (PLA und PLC), die MAPK oder die Adenylatzyklase (LOEFFLER, 1998a; ROZENGURT, 2007).
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von GPR durch Klonierung identifiziert, für die bisher keine Liganden bekannt waren. Diese werden als „orphan GPRs“
bezeichnet (orphan (engl.) = Waise) (LE POUL et al, 2003), und werden durch Nummerierung unterschieden. Für eine Reihe dieser Rezeptoren konnten kurz-, mittel- und langkettige Fettsäuren als Liganden nachgewiesen werden, die als GPR40, 41, 42 und 43 klassifiziert sind (BRISCOE et al., 2003; BROWN et al., 2003;
LE POUL et al., 2003). Ihre Expression kann in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden, wie in den Granulozyten des Blutes und in Adipozyten. Ihrem Vorkommen in Abwehrzellen wird eine nutritiv-regulative Rolle bei der Immunantwort zugesprochen. Im Fettgewebe ist der GPR41 von besonderem Interesse, da dieser Rezeptor die Leptinexpression im Fettgewebe und Plasmaleptingehalte bei Mäusen erhöht, und somit von Bedeutung für die hormonelle Kopplung von Nahrungsaufnahme und Energiestatus des Körpers sein könnte. Die höchste Stimulation wird durch Propionat erreicht (XIONG et al., 2004). In Anbetracht dessen, und der Bedeutung von Propionat beim Wiederkäuer, ist die Untersuchung des GPR41 bei dieser Tiergruppe von großem Interesse.
Zur Klassifizierung des G-Proteins des GPR41 konnte in Untersuchungen mit Pertussistoxin die Funktion dieses Rezeptorproteins aufgehoben werden.
Pertussistoxin hemmt spezifisch die G-Proteine der Gi/0-Familie (BROWN et al., 2003). LE POUL et al. (2003) wiesen außerdem den Abfall des intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP), die Bildung von Inositol-(1,4,5)- Triphosphat (‚IP3) und Freisetzung des intrazellulären Ca2+ und die Phosphorylierung zweier MAPK (p42 und p44), nach. Dies weist darauf hin, dass der GPR41 über drei verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden, die Hemmung der Adenylatzyklase, sowie die Aktivierung der Phosphatidylinostol 3-Kinase (PI3-K), die wiederum durch die Phospholipase C aktiviert wird, und einer MAPK, verfügt. Nach BROWN et al.
(2005) kann somit der GPR41 der Familie der (inhibitorischen) Gαi-assoziierten Rezeptoren zugeordnet werden.
Verschiedene Autoren wiesen wechselseitige Beeinflussung der GPR und Insulinrezeptoren nach (MOXHAM u. MALBON, 1996; KATADA et al., 1999; YU et al., 2001). Aufgrund des funktionellen Zusammenhangs von Leptin und Insulin, und der nachgewiesenen Sekretion von Leptin durch den GPR41, untersuchten XIONG et al. (2004) mögliche Einflüsse von Insulin auf die Rezeptoraktivität. Dabei konnten sie zeigen, dass die Leptinproduktion bei geichzeitiger Gabe von Propionsäure und
Insulin mehr als nur additiv erhöht war, und schließen danach auf Wechselwirkungen zwischen Insulin und GPR41.
Der Insulinrezeptor ist ein tetrameres Molekül aus zwei identischen Teilen bestehend aus je einer α- und β-Untereinheit. Die β-Untereinheiten durchziehen die Cytoplasmamembran, während die beiden α-Untereinheiten extrazellulär gelegen sind. Hier sind die beiden Teile durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden.
Insulin bindet an die α-Einheiten. Eine Konformationsänderung aktiviert intrazellulär eine Tyrosinkinase. Nach der Phosphorylierung bindet das spezifische Protein IRS-1 (Insulin Rezeptor Substrat). Durch Phosphorylierung werden verschiedene Enzyme wie die PI3-K, aktiviert (PLUM et al., 2006; KASHYAP u. DEFRONZO, 2007).
Mögliche Kreuzungspunkte der Signaltransduktion bildet bei den Monogastriern dieses Enzym. In Untersuchungen an kultivierten humanen Adenokarzinomzellen bestätigten KISFALVI et al. (2007), dass über die PI3-K der G-proteinvermittelte Rezeptormechanismus und der Insulinrezeptor kommunizieren können. Der genaue Mechanismus der Beeinflussung, die Verhältnisse am GPR41 in den Adipozyten und die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Wiederkäuerzellen jedoch erfordern noch weitere Untersuchungen (s. Abb.1).
Auf die Zusammenhänge von Insulin, Glukose, Fett und Fettsäuren auf der einen, und Leptin auf der anderen Seite, wurde im Vorhergehenden eingegangen. Neben der energetischen Regulation, ist dieser Sachverhalt insbesondere in der Trächtigkeit, in der Laktation, und in der Umstellung des Metabolismus im Zeitraum der Geburt wichtig. Dem Wechsel zwischen erhöhter und verminderter Leptin- und Insulinresistenz in diesen Stadien, wird eine tragende Rolle beigemessen.
Bei Schafen steigt zirkulierendes Leptin zu Beginn der Trächtigkeit an, und bleibt bis zur Geburt erhöht. Auch bei Kühen ist die Leptinplasmakonzentration im Verlauf der späten Trächtigkeit bis vor der Geburt erhöht. Nach LIEFERS et al. (2005) ist dies nach den bisherigen Kenntnissen auf einen Anstieg des Körperfettanteils einerseits, andererseits auf eine Leptinresistenz zurückzuführen. Als Ursache konnte beim Schaf in diesem Zeitraum mehr Bindungsprotein nachgewiesen werden, bei der Ratte konnte zudem eine Abnahme der Ob-Rb-Expression, und verminderter Transport über die Blut-Hirn-Schranke gezeigt werden. Dies führt aufgrund eines geringen Feed-back zu einer Erhöhung der Leptin-mRNA-Expression im Fettgewebe.
Diese Expression wird durch Insulin nicht beeinflusst (CHILLIARD et al., 2005;
LIEFERS et al., 2005).
Um den Geburtszeitraum fällt Plasmaleptin innerhalb von 3-4 Wochen bei Kühen ab (BLOCK et al., 2001; CHILLIARD et al., 2005; HACHENBERG et al., 2007). Beim Schaf sind ähnliche Verhältnisse zu sehen, allerdings hängt der Abfall sehr von der Energiezufuhr ab. Während der ersten drei Laktationswochen sind Leptin-mRNA und -protein in allen Fällen niedrig (CHILLIARD et al., 2005).
Für den Verlauf der Leptinwerte peri partum bei der Ziege gibt es die Besonderheit, dass sich bei diesen Tieren, im Gegensatz zu zum Rind, die frühe Trächtigkeit und späte Laktation überschneiden. Vermutlich sind die Regulationsmechanismen grundsätzlich dieselben, es überdecken sich aber dabei verschiedene Effekte.
Bei nulliparen Ziegen verläuft die Leptinkurve mit einem Anstieg um die Mitte der Trächtigkeit, und einem deutlichen Abfall im Übergang zur Laktation. Bei primiparen laktierenden, trächtigen Ziegen gibt es keinen Anstieg des Leptinspiegels in der
Abb. 1: Schematische Darstellung der Signalkaskaden des GPR41 und der möglichen Überkreuzung der Signalwege mit dem Insulinrezeptor durch Stimulation der PI- 3K.
Erklärung: Giα: α-Untereinheit des inhibitorischen G-Proteins; Adenzyk.:
Adenylatzyklase; PLC: Phopholipase C; IRS-1: Insulin Rezeptorsubstrat 1; PI3-K:
Phospatidylinositol 3-Kinase; IP3: Inositol Triphosphat; MAPK: mitogen-aktivierte Proteinkinase; PP: Pyrophosphat
(In Anlehnung an: LOEFFLER, 1998a; BROWN et al., 2005; PLUM et al., 2006;
KASHYAP u. DEFRONZO, 2007; ROZENGURT, 2007) GTP
Giα Giα
Propionat
GDP GTP
Giα
GTP
PLC
↑
GTP Adenzyk.
↓
ATP
GPR41
cAMP P P PI3-K
↑
IP3
↑
Ca++
↑
MAPK
↑
Insulin
Insulinrezeptor
P
P P P
P PI3-K
↑
IRS-1 extrazellulär
intrazellulär GTP
Giα Giα
Propionat
GDP GTP
Giα
GTP
PLC
↑
GTP Adenzyk.
↓
ATP
GPR41
cAMP P P PI3-K
↑
IP3
↑
Ca++
↑
MAPK
↑
Insulin
Insulinrezeptor
P
P P P
P PI3-K
↑
Insulin
Insulinrezeptor
P
P P P
P Insulin
Insulinrezeptor
P
P P P
P PI3-K
↑
IRS-1 extrazellulär
intrazellulär
Trächtigkeit, die Kurve fällt jedoch zu Beginn der Laktation ebenfalls leicht ab.
Vergleicht man laktierende primipare trächtige Tiere mit laktierenden primiparen güsten Tieren, kommt es nach dem Trockenstellen bei Letzteren zu einem Anstieg von Leptin auf das Vierfache, während bei den trächtigen Ziegen, Leptin auf demselben Niveau bleibt.
Fasst man diese Ergebnisse zusammen, zeigt sich, dass die späte Laktation einen dominierenden Effekt darstellt, in dem der Leptinspiegel auf einem niedrigen Niveau verläuft. Dieser Effekt überwiegt den Anstieg in der Trächtigkeit. Dies zeigt zum einen, dass unterschiedliche Regulationsmechanismen durch Laktation und Trächtigkeit bestehen. Zum anderen sind dies weitere Hinweise auf die Bedeutung von Leptin beim Nutrient partitioning. Zusammen mit den erwähnten Untersuchungen von WANG et al. (1999b) und ZIEBA et al. (2005) zeigt dies, dass dieser niedrige Leptinspiegel in der Laktation für die Entstehung der Insulinresistenz in der Laktation verantwortlich sein kann (BONNET et al., 2005; CHILLIARD et al., 2005).
Nach LIEFERS et al. (2005) könnte ein Teil des Leptinabfalls zu Beginn der Laktation durch den Abbau von Fettgewebe in Folge negativer Energiebalance entstehen.
Wenn bei laktierenden Ratten oder Rindern die Laktogenese verhindert wird, und somit der Energieverlust über die Milch abfällt, steigt der Plasmaleptinspiegel (BLOCK et al., 2001). Nach LIEFERS et al. (2005) zeigt dies, dass die energetische Situation den Abfall von Leptin beeinflusst. Außerdem führt erniedrigtes Insulin zu einem Abfall von Leptin, sich also Leptin und Insulin gegenseitig beeinflussen (BLOCK et al., 2003; LIEFERS et al., 2005). Wenngleich einzelne Zusammenhänge bereits gezeigt werden konnten, ist das Zusammenspiel dieser Komponenten in der homöorhetischen Gesamtbetrachtung noch nicht hinreichend bekannt.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit eine intravenöse Kurzzeitinfusion von Propionat, als dem Hauptmetaboliten der ruminalen Energieversorgung, Einfluss auf die Leptinsynthese im Fettgewebe von Ziegen hat. Um die Rolle der Leptinsynthese und der –sekretion abschätzen zu können, wurde sowohl die mRNA, als auch das Protein, im Kontext der Veränderungen von Insulin, Glukose und freien langkettigen Fettsäuren, im Blut gemessen. Zudem sollten mögliche Einflüsse auf periphere Regulationsmechanismen durch die Propionatinfusion untersucht werden.
Dazu wurde die Menge der Ob-Rb-mRNA und des GPR41 im Fettgewebe quantifiziert.
Ein weiteres Ziel war, die Zusammenhänge zwischen Insulinsensitivität und Plasmaleptinspiegel bei graviden und frühlaktierenden Ziegen zu beleuchten. Im Fokus stand dabei auch der mögliche Einfluss des Glukoseeffluxes über die Laktose in der Milchsynthese.
2. Material und Methoden 2.1 Versuchstiere
2.1.1 Haltung und Fütterung
Die Tiergruppen beider Versuche wurden in einem Laufstall auf Stroheinstreu gehalten. Heu stand in zwei Raufen zur freien Verfügung und wurde durch die tägliche Gabe von Kraftfutter (1550 KOFU VIII, KOFU Tiernahrung Kottmann, Neuss) ergänzt. Die Ziegenböcke erhielten 100 g/d Kraftfutter je Tier, die trächtigen Ziegen 500 g/d. Den laktierenden Ziegen wurde die Ration individuell nach Milchleistung (300 g/l) zugeteilt. Zudem waren eine Selbsttränke sowie ein Salzleckstein (KNZ S.C.
Akzo Nobel Salz GmbH, Stade) angebracht.
2.1.2 Versuchsablauf
Am Abend vor dem Versuch wurden die Probanden durch ein Gatter von der Gruppe abgetrennt, um die Aufnahme von Heu zu unterbinden und um vergleichbare Ausgangsbedingungen zu schaffen. Wasser und Stroh zur Erhaltung der Pansentätigkeit stand diesen Tieren weiter zur freien Verfügung. Als Zugabe in die Infusionslösungen wurde, unter aseptischen Bedingungen, 10 ml Blut, zur Herstellung tiereigenen Serums, entnommen (20 min, 3000 g; Biofuge primo R, Heraeus Instruments GmbH, Osterode).
Am Morgen des Versuchstages wurde unter Lokalanästhesie (Procasel 2 %, Selectavet, Weyarn-Holzolling) ein intravenöser Dauerverweilkatheter (Cavafix Certo mit Splittocan, Braun Melsungen AG, Melsungen) über die V. jugularis externa in die V. cava cranialis verbracht. In die V. jugularis externa der kontralateralen Seite wurde eine Venenverweilkanüle eingeführt (Vasocan, Braun Melsungen AG, Melsungen). Dieser Katheter diente der regelmäßigen Entnahme der Blutproben. Für die Durchführung der Infusionen wurde das Versuchstier, unter Sicht-, Geruchs- und Hörkontakt zur Tiergruppe, in einem Kastenstand fixiert. Stroh und Wasser wurden ad libitum angeboten. Zum Erhalt der Durchgängigkeit und zur Prävention von Thrombenbildung im Katheter wurde dieser regelmäßig mit heparinhaltiger Ringerlösung (10 I.E./ ml; Braun Melsungen AG, Melsungen) gespült (Heparin-Natrium-5000-ratiopharm, Merckle GmbH, Blaubeuren).
Die Lösungen wurden mittels einer kalibrierten, peristaltischen Pumpe (Meredos HP- 60 12 AC/DC, Meredos GmbH, Bovenden) infundiert.
2.1.3 Tierschutz, Tierbetreuung und Belastungsbeurteilung
Die Tiere wurden mehrmals täglich von einer Betreuungsperson beobachtet. Vor Versuchsbeginn wurde jedes Tier einem allgemeinen klinischen Untersuchungsgang unterzogen, und insbesondere die innere Körpertemperatur gemessen. Bei Abweichungen von den physiologischen Werten wurde der Versuch nicht durchgeführt. Während des Versuches wurde in regelmäßigen Abständen Atmung, Puls, Herztöne, Pansenaktivität und Körpertemperatur überwacht. Die Nachkontrolle erfolgte in der Regel für drei Tage mit Kontrolle und Pflege der Einstichstellen.
Die Katheterisierung und Blutentnahme sind Eingriffe, die bei Mensch und Tier routinemäßig ohne Betäubung durchgeführt werden. Katheter, Fixation und Manipulation schienen die Tiere in ihrem Verhalten nicht wesentlich einzuschränken.
Alle Tiere ruminierten, fraßen Stroh und käuten wieder. Sie zeigten während des Versuches keine wesentlichen Unterschiede in den Ruhe- und Aktivitätsphasen.
Allerdings zeigten mehrere Tiere am Ende des Versuches Ermüdungsanzeichen und Erhöhung der Kreislaufparameter, die sich in allen Fällen nach wenigen Stunden normalisierten. Diese Belastung des Allgemeinbefindens über einen begrenzten Zeitraum ist als mäßig einzuschätzen. Keines der Tiere zeigte aufgrund der Versuchsbehandlung klinisch relevante Folgeerscheinungen. Die Belastung der Tiere durch die Infusionen ist als gering bis mäßig einzustufen.
Aufgrund der Durchführung von Vorversuchen unterlagen die Ziegenböcke der Propionatinfusion 3 bis 4 Eingriffen. Zwischen zwei Versuchen lag mindestens eine Woche Pause.
Die angewandte Infusionsrate im Propionatversuch wurde aus Erfahrungen in Vorversuchen als die höchstmögliche Infusionsrate bei mäßiger Beeinträchtigung der Versuchstiere eingeschätzt. Im Anschluss an den Versuch wurden die Tiere zum Zweck der Probengewinnung getötet.
2.2 Bestimmung von Metaboliten und Hormone im Blut
2.2.1 Glukose
Die Glukosemessungen konnten mit dem tragbaren Glukoseanalyser YSI 1500 Sidekick Version 2.2 (YSI Incorporated, Yellow Springs, Ohio, USA) zeitnah und direkt im Versuchsstall durchgeführt werden. Dieses Gerät ist für die Messung in Vollblut, Blutplasma und -serum von Wiederkäuern validiert. Die Messung erfolgte in heparinisiertem Vollblut (Heparin-Natrium-5000-ratiopharm, Merckle GmbH, Blaubeuren).
Durch die Oxidation von Glukose durch eine spezifische Glukoseoxidase wird Wasserstoffperoxid gebildet. In einer zweiten Reaktion, die durch eine Membran, die für Wasserstoffperoxid diffundibel ist, von der ersten räumlich abgetrennt verläuft, wird dieses an einer Platinanode weiter oxidiert. Es entsteht ein dynamisches Gleichgewicht der Bildung und des Abbaus des Wasserstoffperoxids. Die Stromstärke der Elektronen, die an der Sonde freigesetzt werden, ist proportional der Gukosekonzentration in der gemessenen Probe (Herstellerangaben).
2.2.2 Serumgewinnung
Von jeder entnommenen Blutprobe wurde unmittelbar die Glukosekonzentration im Vollblut gemessen (sh. 2.2.1). Für weitere Analysen wurden die Proben auf Eis gekühlt, zur Serumgewinnung zentrifugiert (20 min, 3000 g; Sigma, 1K15, Taufkirchen) und aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C.
2.2.3 Leptin
Zur Erstellung von Verlaufsprofilen der Serumleptinkonzentrationen wurden diese mit einem kompetitiven Enzymimmuntest (EIA) nach SAUERWEIN et al. (2004) gemessen. Als Antiserum diente polyklonales Kaninchenserum, welches gegen rekombinantes ovines Leptin (roLeptin; GERTLER et al., 1998), sowie zwei synthetische bovine Peptidabschnitte gerichtet ist. Zur Herstellung des Tracers wurde roLeptin nach HENNIES et al. (2001) biotinyliert. Die Mikrotiterplatten (EIA plate 9018, Corning Star, Cambridge, MA, USA) wurden mit Schafantikörper gegen
das Fc-Fragment von Kaninchen beschichtet, und freie Bindungsstellen mit Casein abgesättigt. Als Standard wurde roLeptin verwendet.
Dieser Test wurde zur Messung von Leptin in Blutserumproben von Ziegen, Rindern, Schafen, Schweinen und Pferden entwickelt und validiert (SAUERWEIN et al, 2004).
Der Intra-Assay und Inter-Assay Variationskoeffizient beträgt 6,3% (n=12), bzw.
13,9% (n=41).
2.2.4 Insulin
Zur Messung der Insulinkonzentrationen kam ebenfalls ein kompetitiver Enzymimmuntest zum Einsatz. Als Antiserum dienten Meerschweinchen- immunglobuline gegen ovines Insulin. Zur Beschichtung wurden gegen Meerschweinchen-IgG gerichtete Kaninchenantikörper eingesetzt. Bovines Insulin (Sigma-Aldrich) wurde als Tracer nach dem oben genannten Protokoll biotinyliert. Als Standardverdünnungsreihe wurde ebenfalls bovines Insulin verwendet. Dieser Test ist außer für bovine auch für caprine Blutseren validiert (Wiederfindungsrate 98%).
Intra- und Interassay Variationskoeffizient sind bei diesem Test 5,9% (n = 10) und 10,8% (n = 15). Die Abfolge der Arbeitsschritte verlief entsprechend Protokoll (HEINTGES, 2003; SAUERWEIN et al., 2006).
2.2.5 Freie Fettsäuren
Freie (FFA) oder nicht-veresterten (NEFA) Fettsäuren wurden mit einem kommerziell erhältlichen Testkit (Nr. 1 383 175, Roche Mannheim) gemessen. Fettsäuren werden durch Bindung von CoenzymA aktiviert, und oxidiert. Das dabei entstehende Wasserstoffperoxid wird durch enzymatisch katalysierte Farbentwicklung gemessen (SHIMUZU et al., 1980). Der Test ist nach OLIVER et al. (1995), zur Anwendung in Mikrotiterplatten modifiziert. Die kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) werden aufgrund ihrer hohen Flüchtigkeit durch diesen Kit nicht quantifiziert. Als Standard stand eine Palmitinsäureverdünnungsreihe zur Verfügung.
2.3 Effekte einer Propionatinfusion auf das periphere Leptinsystem und Parameter des Glukosestoffwechsels bei der Ziege
2.3.1 Entwicklung von real-time RT-PCR Assays für Leptin (ob), die lange Form des Leptinrezeptors (ob-Rb), den G- proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41) und die 18S rRNA
Ziel war es, die Expression der Gene ob, ob-Rb, und des putativen GPR 41 zu quantifizieren. Funktion und Zweck des GPR41 ist noch unzureichend geklärt, so dass das codierende Segment als Gen des putativen GPR41 bezeichnet wird. Im Text wird vereinfachend die Bezeichnung GPR41 verwendet.
Das ob-Gen codiert für das Proteohormon Leptin. Mit dieser Messung sollen mögliche Veränderungen der mRNA-Menge von Leptin auf RNA-Ebene den Veränderungen von Leptin auf Proteinebene im Blut gegenübergestellt werden. Das ob-Rb-Gen codiert für die lange Form des Leptinrezeptors, während GPR 41, als Rezeptor von kurzkettigen Fettsäuren, geeignet ist bei Mäusen die Leptinexpression zu erhöhen (XIONG et al.; 2004).
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit insbesondere von RNA, aber auch von DNA, gegenüber Nukleasen, wurden alle Arbeitsabläufe mit Schutzhandschuhen durchgeführt. Alle Materialien wurden autoklaviert, sofern sie nicht vom Hersteller bereits nukleasenfrei hergestellt waren. Mit Wasser wird im Folgenden autoklaviertes Reinstwasser bezeichnet. DEPC-Wasser ist mit Diethylpyrocarbonat behandeltes, ribonukleasefreies Reinstwasser.
Die Extraktion der Gesamt-RNA erfolgte nach modifizierter Phenol-Chloroform- Methode (CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987; CHOMCZYNSKI u. MACKEY 1995).
Die Aufbereitung der RNA aus Fettgewebe wurde nach einem modifizierten Protokoll nach LOUVEAU et al. (1991) durchgeführt. (s. Anhang)
2.3.1.1 Mengenbestimmung und Kontrolle der RNA Photometrische Konzentrationsbestimmung
Nach der Gewinnung der RNA-Präparationen wurde deren Konzentration photometrisch bestimmt. Zusätzlich erhielt man hierbei Aufschluss über
Proteinverunreinigungen der Probe, und somit über den Erfolg der RNA- Aufreinigung. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte photometrisch (Hitachi U- 2000 UV/VIS Spectrophotometer, Hitachi Scientific Instruments, Tokyo, Japan) über die Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 260 nm, da Nukleinsäuren in diesem Wellenlängenbereich ihr Absorptionsmaximum besitzen.
Als Maß für Proteinverunreinigungen wurde das Verhältnis der beiden Wellenlängen 260/280 (OD-Ratio) verwendet, da das Absorptionsmaximum von Proteinen bei 280 nm liegt. Es wurden nur Proben verwendet, deren OD-Ratio-Werte über 1,6 lagen (WILKINSON, 2000). Andernfalls wurde die Aufreinigung mit einer anderen Gewebeprobe des Versuchstieres wiederholt.
Die Messung erfolgte in Doppelbestimmung. Ein relativer Fehler unter 10 % zwischen zwei Messungen wurde akzeptiert. Lag die Abweichung unter 15 % wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt. Der sich daraus ergebende Mittelwert wurde zur Berechnung der Nukleinsäurenkonzentration verwandt. Die Nukleinsäurenkonzentration ist proportional der gemessenen Absorption. Die Konzentrationsberechnung für RNA erfolgte anhand der Formel:
RNA (µg/ml) = OD260 · 40 µg/ml · Verdünnungsfaktor
DNase-Verdau
Um das Risiko falsch-positiver Ergebnisse durch DNA-Kontaminationen in der PCR zu vermindern, wurde eine enzymatische Zerstörung der DNA mit DNase I (DNaseverdau) angeschlossen. Durch diese Behandlung konnte auf die Konstruktion intronspannender PCR-Primer verzichtet werden. Dies war aufgrund der z.T. nur sehr kurzen bekannten RNA-Sequenzen von Vorteil und erleichterte die Auswahl der Primer (BUSTIN, 2002). Die Gesamt-RNA aus Muskelgewebe wurde direkt dem DNaseverdau zugeführt (s. Anhang). Für die Leber- und Fettproben konnte eine bessere Qualität der RNA über eine DNasebehandlung mit Aufreinigung über ein Kitsystem auf Basis der Silicagel-Membrantechnologie (Nucleospin®RNA II, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) erzielt werden. Prinzip der Aufreinigung ist die Bindung der Nukleinsäuren aufgrund ihrer Ladungen unter bestimmten Ionenkonzentrationen an die Membran. Rückstände wie z.B. Salze oder Kohlenhydrate werden in Waschschritten entfernt. Das Protokoll wurde gemäß Herstellerangaben durchgeführt.
Die gesamte isolierte RNA der Fettgewebsproben wurde dieser Aufreinigung zugeführt. Von den Leberproben wurden bis zu 70 µg Gesamt-RNA je Probe gereinigt. Die DNA-Kontaminationen aus Muskel-RNA wurden im 50 µl-Ansatz entfernt. Dazu wurde je Probe eine Menge von 50 µg Gesamt-RNA bearbeitet (s.
Anhang)
Aus den gereinigten Stammlösungen wurden Aliquote mit einer Konzentration von ca. 0,3 µg/µl hergestellt, und danach photometrisch exakt bestimmt. Die Stocklösungen und Reservealiquote wurden bei –80 °C gelagert, die Gebrauchsaliquote lagerten bei –20 °C.
Denaturierende RNA-Gelelektrophorese
Um die Verluste gering zu halten, wurde die RNA ohne vorherige Kontrolle ihrer Integrität gereinigt. Diese Kontrolle erfolgte erst im Anschluss in einer horizontalen, denaturierenden Gelelektrophorese in einem 1,2 % Formaldehyd-Agarosegel, mit Ethidiumbromid als Farbstoff. Als Laufpuffer diente 1X MOPS-Puffer (s. Anhang). Zur Beurteilung der Qualität der Nukleinsäuren wurden 2 µg Gesamt-RNA der Fettproben, und 5 µg der Muskel- und Leberproben, eingesetzt. Dazu wurden 4 µl Ladepuffer (s. Anhang) zugegeben, und jeweils auf 12 µl mit Wasser aufgefüllt.
Diese Ansätze wurden vor dem Auftrag zusammen bei 65 °C für zehn Minuten im Wasserbad denaturiert. Danach wurden sie sofort auf Eis gestellt, um eine Renaturierung zu verhindern, und in die Taschen des Gels pipettiert. Die Spannung in der Kammer betrug 5 bis 7 V/cm für 80 bis 100 Minuten.
Die Qualität der Präparationen sowie die Länge der darin enthaltenen Fragmente wird in einer Gelelektrophorese kontrolliert. Agarose bildet als Polysaccharid eine dreidimensionale Netzstruktur aus. In dieser kommt es zu einer Auftrennung der RNA-Fragmente in den Präparationen nach ihrer Größe. Fragmente gleicher Größe werden als klar abgegrenzte Bande sichtbar. Werden diese durch Enzyme degradiert, bilden diese unspezifischen Schlieren, da die dabei entstehenden Größen dem Zufallsprinzip unterliegen.
Um die Banden sichtbar zu machen wurde der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid, eingesetzt. Diese aromatischen Kationen lagern sich in die Nukleotidketten ein, und fluoreszieren durch UV-Bestrahlung (s. Anhang).
Die bildliche Darstellung und Dokumentation der Gele erfolgte mit dem FluorImager SI und der dazugehörigen Software ImageQuant, Version 4.1 (beide: Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA).
2.3.1.2 Reverse Transkription (RT)
Für den indirekten Nachweis der RNA mittels PCR, wurde diese in cDNA umgeschrieben (Reverse Transkription). Als Startmoleküle für die reverse Transkriptase, einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, dienten random hexamer Primer. Diese Oligomere bestehen aus sechs nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung kombinierten Nukleotiden. Die damit dargestellten Sequenzen binden an die jeweilige komplementäre Sequenz der RNA, die beliebig in der Matrize verteilt sind.
Von diesen Primern ausgehend startet die cDNA-Synthese (cDNA = engl.
complementary DNA), bis sie an der nächstliegenden Bindungsstelle eines Hexamers gestoppt wird. Auf diese Weise wird die gesamte in der Präparation vorhandene RNA, incl. der ribosomalen, umgeschrieben. Dadurch war die Verwendung von 18S rRNA als interne Kontrolle in der real-time PCR möglich.
Jede RNA wurde zweimal, in voneinander unabhängigen Ansätzen, umgeschrieben (s. 2.3.2.4). Da die Interassayvarianz in der cDNA-Synthese einen großen Einfluss auf die weitere Quantifizierung haben kann (ØVSTEBØ et al., 2003; STÅHLBERG et al., 2004), wurden je alle Fettproben gemeinsam, und alle Leber- und Muskelproben in einem gemeinsamen Durchlauf, mit demselben Mastermix, transkribiert. Dieses Design wurde dann auch für die PCR-Messungen verwendet. Die Auswertung erfolgte zwischen den Behandlungsgruppen, sowie zum Vergleich der mRNA-Menge zwischen den beiden Fettgeweben.
Die Reverse Transkription zur Synthese der cDNA wurde in einer von der PCR getrennten Reaktion durchgeführt, um eine höhere Sensitivität in der PCR zu erreichen (zur Übersicht: BUSTIN, 2002). Es wurden 1,8 µg RNA im 20 µl-Ansatz eingesetzt (Thermocycler: MJ Research, Biozym Diagnostik, Oldendorf). Ein Teil der hergestellten cDNA wurde gleich im Anschluss in einer zweistufigen Verdünnungsreihe auf 1:4 und 1:40 verdünnt, um die CT (Threshold cycle), die Messgrößen für die Quantifizierung, zwischen Ziel- und Referenzgenen einander anzunähern. Die Lagerung mehrerer Aliquote erfolgte bei -20 °C. Jedes Aliquot wurde zur Auswertung höchstens dreimal aufgetaut.
2.3.1.3 Zielgene und interne Kontrolle für die PCR
Als Zielgene werden im Folgenden jene Gene bezeichnet, deren Expression in diesen Untersuchungen quantifiziert werden sollten. Das sind die bereits oben erwähnten Gene für Leptin (ob), Leptinrezeptor (ob-Rb) und den G- proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41).
Die interne oder endogene Amplifikationskontrolle dient als Bezugsgröße zur indirekten Quantifizierung des Transkriptionsniveaus der Zielgene. Geeignete RNA- Spezies müssen in allen analysierten Gewebetypen in verleichbarer Menge vorhanden sein, direkt proportional der enthaltenen Gesamt-RNA sein, und ihre Masse darf nur geringen Variationen unterliegen. Für diese Verwendung wurde in diesem Versuch die 18S ribosomale RNA (rRNA) als interne Kontrolle ausgewählt (zur Übersicht: IVELL, 1998; DEINDL, 2001). Im Weiteren wird diese auch verkürzt als 18S bezeichnet. Als aktive Referenz wird diese Kontrolle in einem eigenen Ansatz amplifiziert. Die anhand einer Standardkurve ermittelte theoretische Molekülmenge der Ziel-mRNA wird ins Verhältnis zur Kontrolle gesetzt. Anhand der errechneten Quotienten werden die Einzelproben verglichen und statistisch ausgewertet.
Produktamplifikation für die PCR-Standards
Die Quantifizierung der spezifischen RNA-Mengen erfolgte in der real-time PCR gegen eine Standardverdünnungsreihe (s. 2.3.2.4). Die Fragmente wurden per PCR amplifiziert (Protokolle s. Anhang). Für Leptin und 18S wurde die Zielsequenz der real-time PCR auch zur Herstellung der Standardverdünnungsreihe verwendet. Die Primer, welche die Fragmente für die beiden Rezeptoren festlegen, wurden je auf Grundlage eines längeren PCR-Fragmentes bestimmt. Dieses Fragment wurde bei diesen Assays als Standard eingesetzt.
Die Primer wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Die PCR-Protokolle für die Standardamplifikation sind im Anhang aufgeführt.
Sequenzierung
Die Produkte für die Standardverdünnungsreihen von Leptin- und Leptinrezeptor- RNA wurden nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode (SANGER et al., 1977) mit dem CEQTM Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) mit Quick Start Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) nach folgendem Standardprotokoll sequenziert:
Der Sequenzier-PCR-Mix enthielt 6 µl cDNA, 2 µl Primer und 4 µl DTCS-Mastermix.
Die Cycling Reaktion wurde mit 30 Zyklen bei 96 °C für 20 s, 50 °C für 20 s und 60 °C für 4 min. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µl Stoppreagenz (2 µl 3M NaOAc pH 5,2; 2 µl 100 mM EDTA pH8; 1 µl Glykogen) abgebrochen. Das Produkt wurde mit 99 % Ethanol präzipitiert, gewaschen und getrocknet. Das Pellet wurde in CEQTM-Ladepuffer suspendiert und in den Sequencer (CEQTM8000;
Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) geladen.
Die Sequenzierung der entsprechenden Fragmente von GPR41 und 18S erfolgte durch MWG Biotech AG (Ebersberg). Alle Sequenzierungen wurden sowohl in sense, als auch antisense-Richtung durchgeführt. Als Primer für die Sequenzierung wurden jene aus der PCR verwendet. Die Ergebnisse wurden sowohl anhand der Fluoreszenzpeaks, als auch den Basencodes, visuell kontrolliert. Insbesondere sich überlappende Bereiche wurden auf Widersprüchlichkeiten miteinander verglichen. Im Falle von Leptin und 18S wurden die Ergebnisse mit Hilfe von BLAST (engl.: basic local alignment search tool; ALTSCHUL et al., 1990;
(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/; 2004)) und Multalin Version 5.4.1 (CORPET, 1988) mit der veröffentlichten Sequenz auf Übereinstimmung überprüft.
Leptin
Bei Leptin wurde dieselbe Sequenz für die Standardverdünnungsreihe und die quantifizierende real-time PCR verwendet. Die Primer dafür wurden von YUEN et al.
(2002) übernommen, die ein Fragment von 183 Nukleotiden festlegen. Sie wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Das Ergebnis stimmte mit der veröffentlichten Sequenz ob-mRNA AF372504 (Capra hircus) überein.
18S rRNA
Die Primer für die 18S mRNA wurden anhand der bekannten Sequenz nach AF102857 (Sus scrofa) online mit der Software Primer 3 ( 2004, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, USA) konzipiert. Sie codieren für 81 Nukleotide. Die Bestätigung des amplifizierten Fragments erfolgte durch Vergleich mit der veröffentlichten Sequenz für die Ziege AF379200 (Capra hircus).
Leptinrezeptor
Die partielle cDNA-Sequenz des caprinen Leptinrezeptors wurde auf Basis eines PCR-Fragmentes analysiert, welches für einen Abschnitt von 383 Basenpaaren codiert. Die Primer dazu wurden nach LIN et al. (2000) synthetisiert, die ursprünglich vom Schwein (AF092422; Sus scrofa) abgeleitet sind. Das Sequenziergebnis wurde in Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/; 2005) unter der Accession number AY846770 veröffentlicht (Capra hircus leptin receptor long form mRNA, partial cds). Auf Basis dieser Sequenz wurden die Primer für eine real-time PCR konzipiert. Zum Nachweis für die lange Form des Leptinrezeptors wurde ein TaqMan-Kit konstruiert Die Berechnung und Synthese der Primer und der MGB TaqMan-Sonden (MGB = engl. minor groove binder) wurden von Applied Biosystems durchgeführt. Das amplifizierte Fragment hat eine Länge von 89 Basen und die Sonde bindet an den Plusstrang.
Putativer GPR41
Zur Ermittlung einer partiellen cDNA-Sequenz des putativen caprinen GPR41 wurden Primer nach der humanen Sequenz (NM005304) gestaltet, die ein PCR-Produkt mit einer Fragmentlänge von 215 Basenpaare bilden. Das Sequenzierergebnis wurde unter der Accession number AY885226 (Capra hircus putative G-protein coupled receptor 4 mRNA, partial cds.) in Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/;
2005) veröffentlicht.
Dieses Fragment bildete die Ausgangssequenz für die die real-time PCR-Primer und MGB TaqMan-Sonde. Diese wurden von Applied Biosystems konzipiert und sythetisiert. Sie umfassen ein Fragment von 74 Basenpaaren, mit einer Sonde, die an den Reversstrang bindet. Im Folgenden sind die Primer aufgeführt:
Tab. 1: Sequenzen der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Primer und Sonden für die real- time RT-PCR Assays und die RT-PCR-Primer zur Herstellung der Verdünnungsreihen für die Ob-Rb- und GPR41-RNA.
Ob-RNA Primer
Forward: 5`GACATCTCACACACGCAG3`
Reverse: 5`GAGGTTCTCCAGGTCATT3`
18S rRNA Primer
Forward: 5`GCTCCACCAACTAAGAACG3`
Reverse: 5`GGACACGGACAGGATTGAC3`
Ob-Rb-RNA Primer (Standard)
Forward: 5`TCGGAAGATATCAGTGTTGA3`
Reverse: 5`TTGGGATGCTGATCTGATAA3`
GPR 41-RNA Primer (Standard)
Forward: 5`ACCTGATGGCCCTGGTG3`
Reverse: 5`GGTGAGGTTTAGCAACAGCA3`
ob-Rb-RNA Primer und Sonde
Forward: 5`GGAGACAGCCCTCTGTTAAATATGC3`
Reverse: 5`TGAGCTGTTTATAAGCCCTTGCT3`
Sonde: 5`TCGGCTTCACCTGATTTA3`
GPR 41-RNA Primer und Sonde
Forward: 5`TGGTGATCTTCGTGGGCAAG3`
Reverse: 5`CGAGAGGGTGAGATTTAGCAAGAG3`
Sonde: 5`CTGCGGCGCCGCC3`
2.3.1.4 Real-time RT-PCR
Die real-time RT-PCR ist eine Weiterentwicklung der RT-PCR (MULLIS et al., 1986;
RAPPOLEE et al., 1991), bei der die Detektion der amplifizierten Fragmente nicht als Endpunktanalyse in einem Gel durchgeführt wird, sondern durch