2. Material und Methoden 1 Versuchstiere
3.1 Effekte intravenöser Propionatinfusionen auf verschiedene Zielparameter
3.1.1 Beeinflussung der mRNA-Mengen in verschiedenen Geweben
3.1.1.1 Qualität der Gesamt-RNA
Die Gesamt-RNA wurde nach Integrität und Reinheit beurteilt. Die Integrität wurde anhand der 28S und 18S-Bande bestimmt. Ein Verhältnis von 2 : 1 spricht für eine undegradierte, intakte RNA (Ivell, 1998). Wie aus Abb. 4 ersichtlich ist, wurden diese Anforderungen an die Qualität der Gesamt-RNA erfüllt. Bei deutlichen Abweichungen von diesem Qualitätsmerkmale wurde die RNA verworfen, und eine äquivalente Gewebeprobe extrahiert.
3.1.1.2 cDNA-Sequenz der langen Form des Leptinrezeptor und putativen G-proteingekoppelten Rezeptor GPR41 bei der Ziege
Die analysierte partielle cDNA des Leptinrezeptors umfasst 383 Basenpaare (s. Abb. 5), was auch durch die Sequenzierung bestätigt wird. Abzüglich der Primer konnte somit ein 343 Basenpaare umfassendes Segment des langen Leptinrezeptors unter der Accession number AY846770 (Capra hircus leptin receptor long form mRNA, partial cds.) in Genbank veröffentlicht werden. Nukleotid 123 zeigte sowohl bei der Sequenzierung des Plusstranges, als auch des komplementären Stranges
28S rRNA
18S rRNA
Abb. 4: Beispiel einer denaturierenden Gelelektrophorese (Formaldehyd/MOPS) von Gesamt-RNA zur Kontrolle der Qualität nach Extraktion und DNasebehandlung.
ein uneindeutiges Signal, das für Cytidin oder Thymidin spricht. Der Homologievergleich weist an dieser Stelle für Schaf (Ovis aries) und Rind (Bos taurus) Cytidin aus.
Die Übereinstimmung zu diesen Wiederkäuern nach BLAST liegt bei 97 % (U62124) und 94 % (NM001012285), die Sequenz des Schweines weist 83 % (AF036908) Übereinstimmung auf. Die Sequenz stimmt zu 80 % mit jener von Homo sapiens (NM_005304) überein (s. Abb. 7).
Das zu sequenzierende Fragment des GPR41 bestand aus 215 Nukleotiden (Abb.
5). Ohne Primer entspricht das 178 Nukleotiden, die unter der Accession number AY885226 (Capra hircus putative G-protein coupled receptor 41 mRNA, partial cds.) in Genbank veröffentlicht wurden.
Der Homologievergleich mit bereits bekannten Sequenzen zeigt eine Übereinstimmung von 99 % mit der des Schafes (DQ361027), 97 % Rind (XM_605910), und 88 % zur humanen Sequenz (NM_005304) (sh. Abb. 8).
3.1.1.3 Gelelektrophorese der real-time PCR-Amplifikate
In der beispielhaften Darstellung in Abb. 6 sind die amplifizierten Fragmente der real-time RT-PCR-Assays gezeigt. Zum Vergleich der Fragmentlängen ist der Größenmarker ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII) aufgetragen. Die Banden der kurzen Markerfragmente sind in dieser Abbildung allerdings nicht darstellbar. Im Original sind diese jedoch deutlich zu unterscheiden. Alle Banden der PCR-Produkte sind klar abgegrenzt und ohne Schlieren.
1 2 3
Abb. 6: Darstellung der Fragmente von Zielgenen und interner Kontrolle aus der real-time RT-PCR in einem 2%igen Agarosegel mit Puffersystem TBE, gefärbt mit
Ethidiumbromid.
1 u. 6: Marker ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII); 2: 18S rRNA; 3: Leptin; 4:
Leptinrezeptor; 5: G-proteingekoppelter Rezeptor 41 (GPR41).
1 2 3 4 5 6
cLEPR 1 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCTCTGCTTTT 57 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
oLEPR 102 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCCCTGCTTTT 158
cLEPR 58 GACGACTCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 114 ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 159 GAC---TCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 212
cLEPR 115 TCAGTTCTYTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 171 | |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 213 TGAGTTCTCTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 269
cLEPR 172 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 228 |||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 270 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTCGTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 326
cLEPR 229 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTTC 385 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | oLEPR 327 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTCC 383
cLEPR 386 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 343 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oLEPR 384 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 441
cLEPR 1 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCTCTGCTTTT 57 |||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| |||||
bLEPR 2772 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAGCAACTACAGATGCTCTACTTTT 2828
cLEPR 58 GACGACTCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 114 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||
bLEPR 2829 GACGACTCCAGATCTTGAAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAATGCAGCAGTGC 28985
cLEPR 115 TCAGTTCTYTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 1871 ||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||
bLEPR 2886 TCAATTCTCTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGAGAGCAGGAGACA 2942
cLEPR 172 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 228 |||||||||||||||||||||||||||| ||| |||||||||||||||| | |||||
bLEPR 2943 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCAGCAACTCTAAATCAGGTGAAACTGAGGA 2999
cLEPR 229 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTTC 285 ||||||||| |||||||| ||||||| |||||| ||||| ||||||||| ||||| |
bLEPR 3000 GGAGCAAGGACTTATAAATAGCTCAGTCAGCAAATGCTTTTTGAGCAACAATTCTCC 3056
cLEPR 286 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 343 ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bLEPR 3067 ACCAAAGGATTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 3114
Abb. 7: Vergleichende Darstellung der partiellen cDNA-Sequenzen der langen Form des Leptinrezeptors mit ausgewählten Arten: AY846770 Capra hircus (cLEPR);
U62124 Ovis aries (oLEPR); NM001012285 Bos taurus (bLEPR), mit Bindungsstellen der real-time PCR Primer (unterstrichen) und TaqMan-Sonde (Fettdruck).
Quelle: PubMed, Basic local alignment search tool (BLAST) (ALTSCHUL et al., 1990)
cGPR41: 1 ATCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAAT 57 |||||||||||||||||||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||
bGPR41: 137 ATCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGCTGGCTGTGGACGTGCTCTTGCTAAAC 193
cGPR41: 58 CTCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCG 114 ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
bGPR41: 194 CTCACCCTCTCGGATCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCA 250
cGPR41: 115 GCCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCCCTTCTCCAGGTTCCTC 171 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bGPR41: 251 GCCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCCCTTCTCCAGGTTCCTC 307
cGPR41: 172 TTCTTCA 178 |||||||
bGPR41: 308 TTCTTCA 314
cGPR41: 14 AGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATCTCACCCTCTCGG 70 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||
oGPR41: 1 AGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAACCTCACCCTCTCGG 57
cGPR41: 71 ACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGGCCAGTGCCATGC 127 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
oGPR41: 58 ACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGGCCAGTGCCATGC 114
cGPR41: 128 ACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155 ||||||||||||||||||||||||||||
oGPR41: 115 ACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 142
cGPR41: 2 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATC 58 |||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| |||| || | hGPR41: 123 TCTTCGTGGGCAAGCTGCAGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCCTGCTCAACC 179
cGPR41: 59 TCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGG 115 | ||| |||||||||| ||||| |||| |||||||| ||||||||||||||||| | hGPR41: 180 TGACCGCCTCGGACCTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGCCTTTCCGCATGGTGGAGGCAG 236
cGPR41: 116 CCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155 |||| |||||||||||| ||||||||||| || |||||||
hGPR41: 237 CCAATGGCATGCACTGGCCCCTGCCCTTCATCCTCTGCCC 276
cGPR41: 2 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATC 58 |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||| || | hGPR42: 123 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGTGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCCTGCTCAACC 179
cGPR41: 59 TCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGG 115 | ||| |||||||||| ||||| |||| |||||||| ||||||||||||||||| | hGPR42: 189 TGACCGCCTCGGACCTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGCCTTTCCGCATGGTGGAGGCAG 236
cGPR41: 116 CCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155 ||| |||||||||||| ||||||||||| || |||||||
hGPR42: 237 CCAATGGCATGCACTGGCCCCTGCCCTTCATCCTCTGCCC 276
Abb. 8: Vergleichende Darstellung der partiellen cDNA-Sequenzen des GPR41 mit ausgewählten Arten: AY885226 Capra hircus (cGPR41); XM_605910 Bos taurus (bGPR41); DQ361027 Ovis aries (oGPR41); NM_005304 Homo sapiens FFA(3)R/
hGPR41,
3.1.1.4 Ergebnisse der mRNA-Quantifizierung
Die Ergebnisse der Standardkurvenvalidierung sind in Tab. 2 dargestellt. Die Ergebnisse der relativen Quantifizierung sind im Anhang, sowie graphisch in Abb. 9 dargestellt (Mittelwerte ± SEM).
Der Variationskoeffizient der cDNA-Synthesen wurde anhand der Quantifizierungsergebnisse (DNA-Menge) von 18S für die beiden cDNA-Proben einer RNA-Präparation ermittelt. Er liegt für alle Reaktionen zwischen 5-84%. Nach Geweben geordnet betragen diese 21-84% in Leber-, 5-45% in Muskelgewebe und 8-30% in Organ- bzw. Subkutanfettgewebe
.
Der durchschnittliche Variationskoeffizient der Duplikate (DNA-Menge) in den PCR-Assays beträgt 9-19% (18S rRNA), 9-14% (Leptin), 8-16% (Leptinrezeptor) und 10-16% (putativer GPR41).
Tab. 2: Effizienz und Wiederholbarkeit der real time RT-PCR
Fragment Effizienz
(Mittelwert ± SEM)
Interassay Variationskoeffizient Leptin 1,95 ± 0,02 (n = 8) 9,4% (n = 9) Leptinrezeptor 2,05 ± 0,09 (n = 6) 11,8% (n = 5) G-proteingekoppelter
Rezeptor
1,98 ± 0,04 (n = 5) 4,0% (n = 5)
18S rRNA 2,01 ± 0,05 (n = 5) 11,9% (n = 6)
3.1.1.4.1 Unterschiede der mRNA-Mengen in den Fettgeweben
Es bestanden keine signifikanten Unterschiede der mRNA-Menge von Leptin, Leptinrezeptor und putativem GPR41 zwischen Subkutanfett und Perirenalfett.
Allerdings ist die mRNA von Leptin (p = 0,060) und des Leptinrezeptors (p = 0,095) im Subkutanfett tendenziell höher exprimiert, als im Perirenalfett. Demgegenüber
mit Bindungsstellen der real-time PCR Primer (unterstrichen) und TaqMan-Sonde (Fettdruck).
Quelle: PubMed, Basic local alignment search tool (BLAST) (ALTSCHUL et al., 1990)
wird tendenziell mehr GPR41-mRNA im Perirenalfett als im Subkutanfett nachgewiesen (p = 0,062).
3.1.1.4.2 Leptin
Die Propionatinfusion führt im perirenalen Fettgewebe zu einer tendenziellen Erhöhung der Leptin-mRNA um das 3,2-fache (p = 0,081). Im subkutanen Fett ist der Mittelwert etwas erhöht, erreichte jedoch kein signifikantes Niveau (1,9-fach, p = 0,106).
3.1.1.4.3 Lange Form des Leptinrezeptors
Die Mittelwerte der ob-Rb-mRNA sind in allen vier untersuchten Gewebearten in der Propionatgruppe geringer als in der Kontrollgruppe. Signifikante Unterschiede lassen sich allerdings nur im perirenalen Fett nachweisen (4,2-fach; p= 0,042). Die Absenkungen durch die Behandlung um das 4,5, 2,6 bzw. 1,7-fache im Unterhautfett, Muskel- und Lebergewebe sind nicht signifikant (p = 0,286; p = 0,127 u. p = 0,338).
3.1.1.4.4 Putativer G-proteingekoppelter Rezeptor GPR41
Der Vergleich der GPR41-mRNA in den beiden Fettgewebsarten zeigt eine deutliche Erhöhung in den subkutan entnommenen Proben bei der Propionatgruppe (12-fach;
p=0,029). In den perirenal entnommen Proben ist kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen zu verzeichnen (p = 0,756).
Relative Genexpression [Leptin / 18S rRNA] Perirenalfett
Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Muskel
Relative Genexpression [GPR41 / 18S rRNA] Perirenalfett n.s. Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Perirenalfett Relative Genexpression [Leptin / 18S rRNA] Perirenalfett
p < 0,1
Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Muskel
Relative Genexpression [GPR41 / 18S rRNA] Perirenalfett n.s. Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Perirenalfett Relative Genexpression [Leptin / 18S rRNA] Perirenalfett
p < 0,1
Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Muskel
Relative Genexpression [GPR41 / 18S rRNA] Perirenalfett n.s. Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Perirenalfett Relative Genexpression [Leptin / 18S rRNA] Perirenalfett
p < 0,1
Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Muskel
Relative Genexpression [GPR41 / 18S rRNA] Perirenalfett n.s. Relative Genexpression [Leptinrezeptor/ 18S rRNA]
Perirenalfett
Abb. 9: Vergleich der mRNA-Expression zwischen Propionat- und Kontrollgruppe.
Die Darstellung zeigt die relative mRNA-Menge von Leptin, Leptinrezeptor und GPR41 zu 18S rRNA in Leber, Muskel, perirenalem und subkutanem Fett (Mittelwerte ± SEM).
NaCl-Kontrolle Propionat