Untersuchung von Kreuzreaktionen

Im Zuge der Immunmarkierung an elektronenmikroskopischen Präparaten sollte auch eine mögliche Kreuzreaktion des rabbit anti-Iho670 Antikörpers mit Zellen bzw. Zellanhängen von I. pacificus und I. islandicus, sowie mit der Co-Kultur, bestehend aus I. hospitalis und Nanoarchaeum equitans, untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden Immunmarkierungen an analog zu den Versuchen mit I. hospitalis vorbereiteten Präparaten dieser Organismen durchgeführt. Einerseits wurden hochdruckgefrorene, gefriersubstituierte und in Epon eingebettete Präparate verwendet, andererseits wurden bewachsene Goldgrids für Immun-markierungsexperimente markiert.

Abb. III.10: Versuche zur Kreuzreaktion; A: Immunmarkierung auf mit I. pacificus bewachsenen kohlebeschichteten Goldgrids, prim. Antikörper rabbit Iho670 1:10, sek. Antikörper goat anti-rabbit IgG + 6 nm Gold 1:5, Negativkontrastierung; B: Immunmarkierung an Ultradünnschnitten von I. islandicus, prim. Antikörper rabbit anti-Iho670 1:100, sek. Antikörper goat anti-rabbit IgG + 6 nm Gold 1:50, Negativkontrastierung (incl. Kontrastverstärkung mit PbCi)

Weder an Präparaten von I. pacificus, noch an Präparaten von I. islandicus konnten elektronenmikroskopisch Signale des rabbit anti-Iho670 Antikörpers detektiert werden (siehe Abb. III.10). Dabei spielte es keine Rolle, ob für die Immunmarkierung bewachsene Goldgrids (mit oder ohne Hitzebehandlung) oder in Epon eingebettete Zellen (nach HPF und FS) verwendet wurden. Zwar sind in Abb. III.10 A 6 nm Goldpartikel zu sehen, jedoch liegen

diese nicht in Assoziation mit den Zellanhängen vor, sondern sind als Hintergrund-verschmutzung anzusehen. Ebenso verhielt es sich mit den markierten Ultradünnschnitten (siehe Abb. III.10 B). Wenn an diesen Signale ausgemacht werden konnten, war keine Präferenz für bestimmte Zellabschnitte auszumachen. Des Weiteren lagen die Goldpartikel in diesen Präparaten in der gleichen Verteilung vor wie in der Zellperipherie bzw. dem restlichen Einbettungsmedium, so dass diese Signale als Hintergrundverschmutzung anzusehen waren. Eine Immunmarkierung mit dem gegen die Zellanhänge von I. pacificus gerichteten Antikörper rabbit anti-LPC (Meyer, 2007) diente als Positivkontrolle und zeigte die erwartete Markierung der Zellanhänge auf mit I. pacificus bewachsenen Goldgrids bzw.

der äußeren und der cytoplasmatischen Membran von I. pacificus auf Ultradünnschnitten (siehe Meyer, 2007).

Abb.III.11: Kreuzreaktion des rabbit anti-Iho670 Antikörpers mit auf kohlebeschichteten Goldgrids kultivierten N. equitans-Zellen (in Co-Kultur mit I. hospitalis), prim. Antikörper rabbit anti-Iho670 1:10, sek. Antikörper goat anti-rabbit IgG + 6 nm Gold 1:5, Negativkontrastierung

Kreuzreaktionen des rabbit anti-Iho670 Antikörpers mit Präparaten der Co-Kultur aus I.

hospitalis und N. equitans zeigten für I. hospitalis analoge Ergebnisse an, wie bereits unter Kap. III.2.3 bzw. III.2.5 für die Reinkultur Kin4/I dargestellt. N. equitans selbst zeigte in Ultradünnschnitten keine Markierungen, jedoch konnten in einigen Präparaten aus Aufwachsversuchen Zellen von N. equitans beobachtet werden, welche Antikörper-markierungen an von der Zelle ausgehenden Filamenten aufwiesen (siehe Abb. III.11).

Somit stellt sich die Frage, ob N. equitans neben Lipiden (Jahn et al., 2004) und anderen Metaboliten auch Bestandteile seiner Zellanhänge von I. hospitalis importiert. Dies wird unter Kap. IV.1.4 in der Diskussion näher behandelt.

2.7 Co-Immunpräzipitation

Innerhalb dieser Arbeit sollte die Durchführung einer Co-Immunpräzipitation (IP) der Identifizierung neuer, am Aufbau oder der Verankerung der Fiber beteiligter Proteine dienen.

Zu diesem Zweck wurde eine mit Triton X-100 aufgeschlossene I. hospitalis-Zellsuspension mit rabbit anti-Iho670 Antikörpern versetzt und für 2 Stunden in einem Rollerdrum inkubiert.

Im Zuge dieser Inkubation soll es zu spezifischen Bindungen des Antikörpers mit seinem Zielepitop kommen. Durch Zugabe von Protein A Sepharose Beads bilden sich im folgenden Inkubationsschritt Komplexe zwischen Antigen, Antikörper und den Protein A Sepharose Beads, welche leicht abzentrifugiert werden können. Liegt nun das Zielprotein Iho670 mit weiteren Proteinen assoziiert vor, kommt es automatisch auch zu einer Abzentrifugation dieser assoziierten Proteine, welche in der nachfolgenden SDS-PAGE detektiert werden können.

Den ersten Schritt der Immunpräzipitation stellte der Nachweis des Iho670-Proteins in der Überstandsfraktion des Zellaufschlusses dar, welche für die IP eingesetzt werden sollte. Dies wurde über Western Blot Analysen erfolgreich getestet (Daten nicht gezeigt).

Im Anschluss wurde die IP wie unter Kap. II.6.4 beschrieben durchgeführt und sämtliche Fraktionen mittels Western Blot und daran durchgeführter Immunlokalisation mit dem rabbit anti-Iho670 Antikörper getestet. Dabei wurden die Western Blot Analysen vor allem zur Optimierung der Bedingungen verwendet. Zeigte sich ein signifikanter Unterschied in der Intensität der 33 kDa Bande zwischen dem IP-Ansatz und der Negativkontrolle, bei welcher die Zellsuspension ohne rabbit anti-Iho670 Antikörper, jedoch mit Protein A Sepharose Beads inkubiert wurde, wurden diese Ansätze für SDS-PAGEs mit modifizierter Silberfärbung verwendet. Dabei war es wichtig, stets gleiche Volumina der Fraktion der Immunpräzipitation, der Negativkontrolle und der Kontrolle, in welcher nur Beads und Antikörper aufgetragen wurde, zu verwenden, um vergleichbare Ergebnisse zu garantieren.

Das Ergebnis einer erfolgreichen Co-IP ist in folgender Abbildung dargestellt:

Abb. III.12: Immunpräzipitation, modifizierte Silberfärbung; Spur 1: Fraktion der IP mit rabbit anti-Iho670 Antikörper, Auftrag: 15 µl; Spur 2: Negativkontrolle zur IP, Zellsuspension ohne prim.

Antikörper, jedoch mit Beads inkubiert, Auftrag: 15 µl; Spur 3: Input-Probe, Auftrag: 5 µl, Spur 4:

ÜS A der IP, Auftrag: 5 µl; Spur 6: ÜS A der Negativkontrolle der IP, Auftrag: 5 µl; Spur 7:

Kontrolle, nur Antikörper mit Beads inkubiert, Auftrag 15 µl, links: Proteinmassenstandard in kDa

Ein direkter Vergleich der Spur der Immunpräzipitation (Spur 1) mit der Negativkontrolle (Spur 2) sowie der Kontrolle, in welcher nur die Signale von Antikörper und Beads dargestellt sind (Spur 6), zeigt deutlich, dass es mit Hilfe der Immunpräzipitation gelang, verschiedene Proteine spezifisch zu fällen. Dabei handelt es sich um Proteine, die in den Banden bei 33 kDa, 35 kDa, 72 kDa und ca. 140 kDa mit Hilfe einer modifizierten Silberfärbung angefärbt werden konnten. In Spur 6 sind deutlich zwei dominante Proteinbanden zu erkennen, die auf die leichte (28 kDa) und die schwere Kette (52 kDa) der eingesetzten Antikörper zurückzuführen ist. Zudem taucht eine Bande bei ca. 110 kDa auf. In der Negativkontrolle der IP ist zu erkennen, dass kein Protein durch eine unspezifische Bindung an Protein Sepharose A Beads in ausreichender Menge gefällt wurde, um über eine modifizierte Silberfärbung angefärbt zu werden. Somit sind die Banden, die in der IP-Fraktion neben den Signalen der Antikörper bzw. der 110 kDa Bande detektiert werden konnten, als spezifisch gefällt anzusehen. Die Spuren 3, 4 und 5 in Abb. III.12 zeigen ein sehr ähnliches Protein-muster. Dabei wurden in Spur 3 und 5 die Überstände der IP bzw. der Negativkontrolle aufgetragen und mit der Input Probe in Spur 4 bzw. den eigentlichen IP- oder Negativkontrollansätzen verglichen. Western Blot Analysen mit dem rabbit anti-Iho670 Antikörper ergaben dabei stets Signale bei 33 kDa in Bande 3, die in etwa der gleichen Intensität auftrat wie in Spur 1 (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass nur ca. 50% der Iho670-Proteine des IP-Ansatzes gefällt werden konnten.

Auch durch mehrere Optimierungsversuche konnte der Anteil der gefällten Iho670-Proteine nicht erhöht werden.

Zur Identifikation der über Co-IP spezifisch gefällten Proteine wurden die silbergefärbten Banden einer Sequenzierung über ESI Nano-LC MS/MS unterzogen. Im Anschluss konnten durch die ermittelten Peptidmassen bzw. Fragmentspektren und einer darauf basierenden Mascot Datenbankrecherche insgesamt 16 Proteine identifiziert werden (Dr. J. Reinders, Institut für funktionelle Genomik, Universität Regensburg). Das Ergebnis dieser Sequenzierung ist in folgender Tabelle zusammengefasst:

Tabelle III.1: Übersicht über die durch ESI Nano-LC MS/MS identifizierten Proteine der Co-Immunpräzipitation

Bande NCBI-Accession Protein Mascot-Score

33 kDa gi|156937463 hypothetical protein Igni_0670 102

gi|156937463 hypothetical protein Igni_0670 106

gi|156937766 phosphate ABC transporter, periplasmic phosphate-binding protein 102 35 kDa

gi|156937322 sulfide reductase, subunit B 89

gi|156938154 nickel-dependent hydrogenase, large subunit 794

gi|156938092 V-type ATP synthase subunit A 325

gi|156938146 multiheme cytochrome 192

gi|156937988 solute binding protein-like protein 182

gi|156936891 thermosome 140

gi|156937791 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 127

72 kDa

gi|156937402 V-type ATP synthase subunit I 115

gi|156938166 putative nitrate reductase, subunit A 424

gi|156937388 vinylacetyl-CoA Delta-isomerase 329

gi|156937640 hypothetical protein Igni_0847 190

gi|156936835 adenosylhomocysteinase 154

140 kDa

gi|156937746 hypothetical protein Igni_0955 88

Dabei war es möglich, den analysierten Banden mehrere Proteine zuzuordnen, was auf die hohe Sensitivität der ESI Nano-LC MS/MS Methode zurückzuführen ist, welche durch eine Kopplung von Flüssigkeitschromatographie (Nano-LC) und anschließender Tandem Massen-spektrometrie (MS/MS) erzielt wird. Die jeweilige Signifikanz der Daten wird durch den Mascot-Scorewert angegeben, der die Wahrscheinlichkeit, dass es sich bei den identifizierten Proteinen um ein zufälliges Ereignis handelt, angibt. Dabei gilt, je niedriger der Mascot-Score, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit eines zufälligen Ereignisses. Alle in dieser Tabelle angegebenen Werte zeigen signifikante Ereignisse an.

Folgende Tabelle soll der Klärung der mutmaßlichen subzellulären Lokalisation der identifizierten Proteine in I. hospitalis dienen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene

Veröffentlichungen sowie das Vorhersageprogramm PSORTb (Version 3.0.1, Yu et al., 2010) verwendet.

Tabelle III.2: über ESI-Nano LC MS/MS identifizierte Proteine und ihre mutmaßliche subzelluläre Lokalisation nach Podar et al., 2008; Psortb und anderen Quellen (CM: Cytoplasmamembran, C:

Cytoplasma, PP: Periplasma, CW: Zellwand, OM: Outer Membrane, EC: extrazellulär, UK:

hypothetical protein Igni_0670 - UK EC (Müller et al.,

2009) phosphate ABC transporter, periplasmic phosphate-binding protein CM C -

sulfide reductase, subunit B CM CM -

nickel-dependent hydrogenase, large subunit CM CM CM (Burghardt, 2008)

V-type ATP synthase subunit A - C/CM OM (Küper et al.,

2010)

multiheme cytochrome - UK -

solute binding protein-like protein CM CW CM/PP (Burghardt, 2008)

thermosome - C C (Burghardt, 2008)

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C C -

V-type ATP synthase subunit I CM CM OM (Küper et al.,

2010)

putative nitrate reductase, subunit A CM C -

vinylacetyl-CoA Delta-isomerase C C -

hypothetical protein Igni_0847 - CW -

adenosylhomocysteinase - C -

hypothetical protein Igni_0955 - UK -