Lokalisation der Ankerstruktur der Fibers

Eine elektronenmikroskopische Analyse von bewachsenen Goldgrids offenbarte unter bestimmten Bedingungen (siehe Kap. III.4) eine Vielzahl von Komplexen, die als Verankerungsstelle der Fibers dienen könnten. Dabei war die Beteiligung von verschiedenen Membran- bzw. Proteintypen zu erkennen, welche nicht genauer definiert werden konnten.

Zudem lagen die Komplexe meist frei, ohne eine Verbindung zu I. hospitalis-Zellen, bzw. nur in Assoziation mit lysierten oder stark beschädigten Zellen vor. Um die intrazelluläre Lokalisation bzw. Verankerung dieser Strukturen zu klären, wurden ausgewählte Ultradünnschnitte einer genauen elektronenmikroskopischen Analyse unterzogen. Des Weiteren sollten Immunmarkierungsexperimente an auf Suspensionspräparaten gefundenen Komplexen dazu dienen, eine Beteiligung der äußeren Membran nachweisen.

5.1 Lokalisation an Ultradünnschnitten

Um die Ankerstruktur der Fibers zu lokalisieren, wurden Ultradünnschnitte von hochdruckgefrorenen, gefriersubstituierten und in Epon eingebetteten I. hospitalis-Zellen angefertigt. Diese schonende Präparationsmethode sollte gewährleisten, dass die Zellen in einem bestmöglichen, nativen Zustand vorliegen, und eine präparationsbedingte Artefaktbildung weitestgehend minimieren. Nach der Kontrastierung der Ultradünnschnitte lag das Hauptaugenmerk auf der Identifikation von Stellen, welche eine Lokalisation des Fiberankers ermöglichen sollten. Hierbei handelte es sich vordergründig um Stellen, an welchen eine Fiber an einer für die Lokalisation der Ankerstruktur günstigen Stellen im Längsschnitt getroffen wurde. Es waren vor allem Stellen, an denen die Fiber die äußere Membran oder das Periplasma passierte, von Interesse sowie Stellen, an denen die Fiber vermeintlich mit der Cytoplasmamembran in Kontakt stand.

Abb. III.20: Ultradünnschnitte von in Cellulosekapillaren kultivierten I. hospitalis-Zellen nach HPF, FS und Einbettung in Epon, alle Aufnahmen zeigen Längsschnitte durch Fiberbereiche, A: ganze Zelle mit Fiber-Längsschnitt unten, durch schwarzen Kasten hervorgehoben; B: vergrößerter Ausschnitt des schwarzen Kastens aus A; C und D: vergrößerte Längsschnitte von Fibers unterschiedlicher I. hospitalis-Zellen und deren Verbindung mit den Zellen; alles Negativkontrastierungen (incl. Kontrastverstärkung mit PbCi); OM: äußere Membran, CM:

Cytoplasmamembran, PP: Periplasma, Fi: Fiber

In Abb. III.20 ist eine Auswahl an Aufnahmen dargestellt, die Stellen zeigen, an welchen die Fibers in bestimmten Bereichen als Längsschnitt zu erkennen sind. Eine Darstellung solcher Abschnitte gelang meist nur über sehr kurze Abschnitte von ca. 200 nm; nur in Ausnahmefällen konnten Bereiche von über 500 nm als Längsschnitt dargestellt werden.

Dies ist im Vergleich mit der Gesamtlänge der Fibers (auf bewachsenen Goldgrids Fibers mit Längen von mehreren 20 µm) ein sehr kurzer Abschnitt, liegt aber darin begründet, dass sich die Fibers nicht exakt in der Ebene des Ultradünnschnitts (Dicke ca. 50 nm) von der Zelle weg erstrecken. Vielmehr dürfte eine Fiber über mehrere Schnittebenen der

Ultra-dünnschnitte verteilt vorliegen. Zudem muss die Möglichkeit, die Fiber quer zu schneiden berücksichtigt werden. Klar ersichtlich ist, dass die Fibers in Abb. III.20 B und D die äußere Membran durchqueren. Aufgrund der zahlreichen feinen Strukturen innerhalb des peri-plasmatischen Raumes kann in Abb. III.20 B jedoch nicht eindeutig erkannt werden, ob sich die Fiber durch die Cytoplasmamembran erstreckt, oder ob sie in dieser Zelle im periplasmatischen Raum endet. Abb. III.20 D dagegen zeigt, dass die Fiber zweifelsfrei mit der Cytoplasmamembran in Kontakt steht; ob sie durch diese hindurch verläuft kann auch hier nicht eindeutig geklärt werden. Allerdings wird bei genauerer Betrachtung der Eindruck vermittelt, dass die Fiber die Cytoplasmamembran überwindet, da diese an der hypothetischen Übertrittsstelle unterbrochen zu sein scheint.

Dennoch ist zu bemerken, dass in allen Aufnahmen keine strukturell definierten Verankerungsstrukturen, die Teil der unter Kap. III.4 beschriebenen Komplexe darstellen könnten, zu erkennen sind. Dessen ungeachtet ist festzustellen, dass alle hier gezeigten Zellen in einem guten Zustand erscheinen. Die Membranen sind klar erkennbar, die äußere Membran ist geschlossen und auf der Oberfläche einiger Zellen sind feine Strukturen zu erkennen, bei denen es sich um Glykosylierungen handeln könnte. Zudem erscheint das Cytoplasma dicht gepackt und regelmäßig, was alles auf einen sehr guten Erhalt der Zellen hindeutet. Auch die Tatsache, dass überhaupt Zellanhänge dargestellt werden konnten, spricht für eine bestmögliche Bewahrung der nativen Struktur.

5.2 Tomographie

Um eine verbesserte Darstellung des Bereichs, in dem die Fiber auf dem in Abb. III.20 A bzw. B dargestellten Ultradünnschnittes mündet, zu erhalten, wurde eine tomographische Analyse wie unter Kap. II.14.2.2 beschrieben, durchgeführt. Das im Rahmen dieser Tomographie erstellte Movie ist dabei auf der Begleit-CD im Anhang zu finden. In folgender Abbildung wurden nun die zwei Ebenen, in welchen einerseits die Fiber, andererseits die äußere sowie die cytoplasmatische Membran zu erkennen sind, einzeln, als auch in übereinander gelegter Form, abgebildet:

Abb. III.21: durch Tomographie ermittelte Schichten (Schichtdicke ca. 1,8 nm) A: der äußeren und cytoplasmatischen Membran; B: der Fiber; C: Überlagerung von A und B; OM: äußere Membran, CM: Cytoplasmamembran, Fi: Fiber

Abb. III.21 lässt klar erkennen, dass die abgebildete Fiber die Cytoplasmamembran der Ignicoccus-Zelle durchquert und in einer runden Struktur ca. 65 nm unterhalb der Cytoplasmamembran mündet. Dabei konnte für die runde Struktur ein Radius von in etwa 35 nm ermittelt werden. Eine Verankerung der Fiber innerhalb der äußeren Membran sowie innerhalb des periplasmatischen Raumes kann somit ausgeschlossen werden.

5.3 Immunmarkierung der Komplexe mit rabbit anti-Ihomp1

Einen weiteren Hinweis, dass die Verankerungsstruktur der Fibers unterhalb der Cytoplasmamembran lokalisiert ist, konnte mit Immunmarkierungsexperimenten mit dem rabbit anti-Ihomp1 Antikörper gewonnen werden. Bei diesen Experimenten wurden Komplexe, welche auf bewachsenen Goldgrids gezielt generiert wurden, einer

Immun-markierung mit diesem Antikörper unterzogen, um eine Beteiligung bzw. das Vorhandensein der äußeren Membran zu untersuchen.

Abb. III.22: Immunmarkierung der auf kohlebeschichteten, bewachsenen Goldgrids generierten Komplexe; prim. Antikörper rabbit anti-Ihomp1 1:10, sek. Antikörper goat anti-rabbit IgG + 6 nm Gold 1:10; Negativkontrastierungen

Die Immunmarkierung der Komplexe mit dem gegen das dominierende Protein der äußeren Membran gerichteten Antikörper weist fast ausschließlich Signale in der Peripherie der Komplexe auf (siehe Abb. III.22). Eine direkte Markierung der Membran (schwarze Pfeile), die die runde Struktur, in welche die Fiber mündet, umschließt, ist nur sporadisch nachzuweisen. Dies bedeutet, dass es sich bei der Membran, die die hier gezeigten Komplexe unmittelbar umschließt, nicht um die äußere Membran, sondern mit hoher Wahrscheinlichkeit um die Cytoplasmamembran handelt. Die äußere Membran liegt bei diesen Komplexen vielmehr als Rest in Teilstücken um diese Membran herum angeordnet vor und zeigt zahlreiche Antikörpersignale. Allerdings sei an dieser Stelle vermerkt, dass auch Komplexe gefunden werden konnten, die neben der Cytoplasmamembran zusätzlich komplett von der äußeren Membran als äußerste Schicht umgeben waren (vgl. Abb. III.18).

Bei derartigen Komplexen zeigte sich eine starke Markierung über die komplette Oberfläche der Komplexe (Daten nicht gezeigt).