Fiber-assoziierte Strukturen der roten Fraktion des CsCl- Gradienten

Zeichnete sich die rote Fraktion zwar nur durch eine geringe Konzentration an Fibers aus, konnten in ihr eine Vielzahl von interessanten Strukturen beobachtet werden, die im Hinblick auf eine Verankerung oder Stabilisierung dieser Zellanhänge eine Rolle spielen könnten. In Abb. III.4 sind einige dieser Strukturen genauer dargestellt:

Abb. III.4: elektronenmikroskopische Darstellung von Fiber-assoziierten Strukturen, die bei der Analyse der roten Fraktionen verschiedener CsCl-Gradienten beobachtet werden konnten; alles Negativkontrastierungen, genauere Erläuterungen siehe Text

Alle oben gezeigten elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen Strukturen, die in Zusammenhang mit den Fiberfilamenten von I. hospitalis beobachtet werden konnten. Mit Hilfe der Funktion Linescan, welche Bestandteil des Programms EM-Menü 4 (TVIPS, Gauting) ist, konnten die einzelnen Bestandteile dieser Strukturen genau vermessen werden.

So ergab sich für das Fiberfilament in allen Aufnahmen ein konstanter Wert von 14–15 nm, egal ob das Filament frei vorlag, oder ob es wie in Abb. III.4 A, B, C, D und F gezeigt, von einer bisher unbekannten Proteinstruktur umhüllt war. In Folgendem sollen nun die hier dargestellten Strukturen näher charakterisiert werden.

Die auffälligsten und am häufigsten zu beobachtenden Strukturen, die mit den Fibers assoziiert waren, stellten Proteinscheiden dar, die das Fiber-Filament umhüllten (siehe Abb.

III.4 A, B, C, D und F, schwarze Pfeile). Diese Strukturen konnten dabei nie als Einzelstrukturen, sondern nur in Verbindung mit Fibers beobachtet werden und besaßen einen Gesamtdurchmesser von 38–40 nm (incl. Fiber), wobei ein lateraler Strang einen Durchmesser von ca. 11 nm einnahm. Bei der Analyse einer Vielzahl von Aufnahmen, die die Fibers in Assoziation mit derartigen Strukturen aufwiesen, wurde im Vergleich mit Aufnahmen von nichtumhüllten Fibers oft der Eindruck von größerer Flexibilität vermittelt, wenn die Fibers in umhüllter Form vorlagen. So nahmen die nichtumhüllten Fibers in den meisten Fällen eine regelmäßige und gerade Verlaufsform ein; bei den Fibers, die mit den eben beschriebenen Proteinstrukturen in Verbindung standen, waren hingegen oft Krümmungen und gewundene Abschnitte zu verzeichnen (vgl. Abb. III.4 F). Bezüglich der Länge, die diese umhüllende, ‚röhrenartige’ Struktur einnimmt, konnte kein konstanter Wert ermittelt werden. So wurden einerseits nur sehr kurze Bereiche, von ca. 40 nm Länge beobachtet, andererseits wurden Bereiche vermessen, in denen mehr als 1 µm der Fiber mit dieser Proteinstruktur in Verbindung stand. Abb. III.4 F zeigt zusätzlich zu dieser Struktur ähnlich aussehende Proteinaggregate (roter Pfeil), die den soeben vorgestellten

‚röhrenartigen’ Strukturen gleichen. Auch hier treten zwei laterale, 11 nm dicke Stränge in Erscheinung, die einen zentralen Part mit einem Durchmesser von 70 nm an der engsten Stelle, bzw. 95 nm an der weitesten Stelle, einschließen. Auch hier wird der Eindruck eines röhrenförmigen Aufbaus vermittelt, in dessen Tunnel die Fiber zu liegen scheint.

In einigen Fällen konnte beobachtet werden, dass das Filament der Fiber in runden bis ovalförmigen Strukturen endete bzw. von diesen ausging, welche in der Mitte einen zentralen Part (Abb. III.4 C und E, weiße Pfeile) besaßen, der eine andere Kontrastierung aufwies als dessen Umhüllung (Abb. III.4 C und E; gelbe Pfeile). Dabei konnte für den zentralen Part ein Radius von 26–30 nm ermittelt werden, für die umhüllende Struktur wurde jeweils ein Durchmesser von 14–15 nm bestimmt. Diese, den zentralen Part umhüllende Struktur wies stets die gleiche Kontrastierung und den gleichen Durchmesser auf wie das davon ausgehende Filament. Jedoch konnte an dieser Stelle nicht geklärt werden, ob es sich hier

um eine Fortsetzung der Fiber bzw. um Strukturen des Fiberproteins Iho670 handelt, oder ob die Umhüllung von einer bzw. mehreren bisher unbekannten Proteinspezies gebildet wird.

Auch in Abb. III.4 F mündet die Fiber in einen ovalförmigen Bereich, der den zuvor beschriebenen Strukturen ähnelt (blauer Pfeil). Allerdings weist dieser Bereich eine weniger klare Strukturierung auf als die in Abb. III.4 C und E dargestellten Bereiche, was auf einen möglichen Kollaps dieser Struktur hindeutet.

Abb. III.4 D zeigt ebenfalls eine unregelmäßig geformte Struktur, in welche die Fiber zu münden scheint (grüner Pfeil). Bei genauerer Betrachtung weist diese Struktur kleine, schwarz erscheinende Poren auf, welche ebenfalls in einigen in der Umgebung liegenden Membranpartikeln zu erkennen sind. Eine zweifelsfreie Klärung der Frage, ob es sich hierbei wirklich um eine Membranstruktur handelt, bzw. zu welcher Art von Membran diese Struktur zuzuordnen ist, war an dieser Stelle nicht möglich.

1.3 N-terminale Sequenzierung des Filamentproteins von I. pacificus Bereits in früheren Arbeiten wurde versucht, die Filamente von I. pacificus näher zu analysieren (Meyer, 2007), um Vergleiche mit den Fibers von I. hospitalis anstellen zu können. Die N-terminale Sequenzierung wurde damals an einer aufgereinigten Fraktion durchgeführt, die nahezu ausschließlich das 39 kDa große Hauptprotein der I. pacificus-Filamente enthielt. Das Ergebnis dieser Sequenzierung ergab 16 Aminosäuren, die mit der N-terminalen Sequenz des aufgereinigten I. hospitalis-Fiberproteins übereinstimmten (Müller et al., 2009). Allerdings waren für alle Positionen noch weitere Aminosäuren möglich, so dass keine eindeutige Zuordnung der N-terminalen Sequenz des Filamentproteins von I.

pacificus getroffen werden konnte. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden nun verschiedene Filamentfaktionen von I. pacificus vereinigt und erneut aufgereinigt (vgl. Kap.

II.5). Nach SDS-PAGE und Western Blot konnte die Bande bei 39 kDa mit Coomassie angefärbt und somit einer N-terminalen Sequenzierung über Edman-Abbau unterzogen werden. Das Ergebnis VSPVIXTLLLILIXVX (X: nicht identifizierbare AS) bestätigte dabei die bereits in Meyer, 2007 vermutete Sequenz und zeigte, dass der N-Terminus des I. pacificus–

Filamentproteins mit dem des Fiberproteins Iho670 von I. hospitalis übereinstimmt. Aufgrund von fehlenden Genomsequenzdaten von I. pacificus kann hier allerdings keine Aussage über die weitere Proteinsequenz des Filamentproteins von I. pacificus getroffen werden.