Untersuchung der Regulation der Transkriptabundanzen der HvSPMS-

Pflanzen eignen sich ihre Quotienten [Tabellen 57/91 bis 63/104]. Positive bzw. negative Quotienten zeigen hoch- bzw. herunter regulierte Dividenden (z.B. rTER gestresste Pflanzen) bezogen auf den Divisor (z.B. rTER Kontrollen) innerhalb und zwischen den Stadien an.

Zusätzlich wird ein Farbcode verwendet. Die statistische Signifikanz wird durch einen Punktcode verdeutlicht.

In allen Tockenstressexperimenten (2012-2014) waren die rTER-Werte der HvSPMS-Gene der gestressten Pflanzen in allen untersuchten Stadien bei zunehmendem TrStr gegenüber den Kontrollen erhöht. Folgende Kernaussagen sind daher festzuhalten:

1.) Die HvSPMS-Gene waren trockenstressinduziert.

Dies wurde bereits in Ath (Hanzawa, et al., 2002) und in Os (Do, et al., 2014) nachgewiesen.

2.) In nahezu allen Stadien waren spätestens bei 10 % WN die rTER-Werte der HvSPMS-Gene der gestressten Pflanzen signifikant gegenüber den Kontrollen erhöht.

Oft waren sie bereits bei moderatem TrStr (20 % WN) gesteigert. Erste Reaktionen zeigten sich bereits bei leichtem TrStr (40 % WN). Auf Ausnahmen (z.B. TrStr-Experiment 2014, (A) [3.3.3.1./99]) wird im Ergebnisteil hingewiesen. In den TrStr-Experimenten von 2012 und 2013 wurden in (A) und (C) besonders stark angestiegene rTER-Werte der gestressten

Pflanzen beobachtet: die Quotienten der rTER-Werte der gestressten Pflanzen waren in Bezug auf die Kontrollen hoch (≥4,0 und höher). Dies spiegelt eine starke Induktion des jeweiligen HvSPMS-Gens in den gestressten Pflanzen wieder. Für die PA-Gehalte der TrStr-Experimente von 2013 und 2014 und für die Bestimmung der rTER-Werte der HvSPMS-Gene im TrStr-Experiment von 2014 wurden daher nur die Pflanzen aus (A) und (C) verwendet. Moderne Gerste im Korn-Füllstadium (C) ist besonders anfällig für Wasserdefizienz (Wu, et al., 2017), was die Bedeutung der Ergebnisse aus (C) unterstreicht.

3.) Besonders in (A) und (C), aber auch in (D) waren beide HvSPMS-Gene deutlich durch TrStr induziert.

Für (B) traf dies nur teilweise zu. Die gestressten Pflanzen aus (A) und (C) zeigten die TrStr-Induktion der HvSPMS-Gene besonders gut an, was jedoch nicht bedeutet, dass Pflanzen dieser Stadien stärker für TrStr anfällig waren als gestresste Pflanzen anderer Stadien. Die Daten aller TrStr-Experimente belegen, dass die gestressten Pflanzen aller untersuchten Stadien die TrStr-Induktion der HvSPMS-Gene anzeigen. Für eine Aussage, in welchen Stadien Gerste besonders anfällig für TrStr ist, sind weitere Kennzahlen wie Frischmasse, Chlorophyllindex, Photosyntheserate o.a. erforderlich.

Im TrStr-Experiment von 2014 wurden zusätzlich zwei trockentolerante Gerstenkultivare untersucht.

4.) Die rTER der HvSPMS-Gene der gestressten Pflanzen in den drei Kultivaren waren in (A) und (C) bei 10 % WN gegenüber den Kontrollen signifikant erhöht.

Innerhalb des Stadiums waren die Quotienten aus gestressten und Kontroll-Pflanzen sehr ähnlich. Beim GP-Kultivar stiegen in (A) die rTER-Werte der Kontrollen des HvSPMS2-Gens bei ansteigendem TrStr ebenfalls an, sodass sich die Quotienten aus gestressten und Kontroll-Pflanzen nicht änderten. Es wurde nur ein Trend ansteigender rTER-Werte beobachtet. Dennoch induzierte TrStr die HvSPMS-Gene in allen drei untersuchten Gerstenkultivaren.

5.) Unterschiede zeigten sich in der Stärke der Induktion bei 20 % WN:

a) In (A) waren die rTER-Werte des HvSPMS1-Gens der gestressten Pflanzen der trockentoleranten Gerstensorten gegenüber ihren Kontrollen stärker erhöht als die des GP-Kultivars.

b) Die Quotienten der rTER-Werte des HvSPMS2-Gens unterschieden sich in (A) nicht.

c) In (C) waren die rTER-Werte beider HvSPMS-Gene der gestressten Pflanzen der trockentoleranten Gerstensorten gegenüber deren Kontrollen weniger stark erhöht als die des GP-Kultivars.

Transgene Gt-SPMS-überexprimierende Ath-Pflanzen zeigten eine gesteigerte Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress und die Induktion von verteidigungsverbundenen Genen (Imamura, et al., 2015). Die Beobachtungen 5.a) und c) sind gegensätzlich. In weiteren Experimente sollte daher geklärt werden, ob die erhöhte Trockentoleranz der trockentoleranten Gerstenkultivare auf eine stärkere oder schwächere Induktion der

HvSPMS-Gene u.a. bei 20 % WN als beim GP-Kultivar zurückzuführen war und ob es sich um einen direkten, indirekten oder inversen Induktionsmechanismus handelt. Die Folge einer hohen HvSPMS-Geninduktion bei TrStr wäre die Bildung höherer Mengen an HvSPMS-Protein in der Pflanze, wodurch mehr SPM im Zytosol verfügbar wäre. Notwendig könnte dies sein, um:

A) SPM zu bilden, das während TrStr-Situationen in der Pflanze verbraucht worden war (direkter Mechanismus) bzw. werden würde, um ggf. SPM-Abbauprodukte (reaktive Sauerstoffspezies wie H2O2 (Efrose, et al., 2008)) zu bilden. Diese könnten wiederum andere (Abwehr-) Regelkreise einleiten (indirekter Mechanismus) (z.B. Induktion von Pathogenabwehr-Mechanismen oder PA-induzierter Stomata-Schluss durch H₂O₂ und NO (Takahashi, et al., 2003; Alcázar, et al., 2010)).

B) einen SPM-Vorrat anzulegen, der z.B. zur Abwehr des TrStr verbraucht werden könnte oder um ggf. direkt einen Abwehrmechanismus einzuleiten, der hohe SPM-Mengen benötigt (z.B. Ca²⁺- und K⁺-vermitteltes, SPM-gesteuertes Stomata-Schließen (Yamaguchi, et al., 2007; Alcázar, et al., 2010)).

C) SPM zu bilden, das in andere Kompartimente verteilt werden soll.

D) SPM zu bilden, um es z.B. zum Schutz an DNA zu binden (Korolev, et al., 2002;

Kusano, et al., 2008) oder aber den Zelltod einzuleiten (Alcázar, et al., 2010) (inverser Mechanismus).

6.) Unterschiede der TrStr-Induktion der HvSPMS-Gene waren zwischen den beiden trockentoleranten Gerstenkultivaren nicht zu beobachten.

7.) Die gestressten Pflanzen wiesen in (C) bei 20 % und 10 % WN in allen TrStr-Experimenten in allen Kultivaren wesentlich höhere rTER-Werte auf als die gestressten Pflanzen in (A).

Demnach wurden die HvSPMS-Gene besonders in (C) durch TrStr induziert.

8.) Das HvSPMS1-Gen ist ab 20 % WN und das HvSPMS2-Gen ist ab 10 % WN als Markergene für TrStr in Gerste anzusehen.

Demnach kann der Anstieg der Transkriptionsraten der SPMS-Gene als Charakteristikum für TrStr angesehen werden. Um dies als alleinigen Marker für TrStr heranzuziehen, sollte der Zusammenhang von sich verändernden rTER-Werten der HvSPMS-Gene und z.B. der Photosyntheserate von Gerstenpflanzen untersucht werden.

Die biologische Relevanz, das die rTER-Werte von HvSPMS2 erst bei 10 % WN erhöht waren, liegt möglicherweise in einem Reserve-Stoffwechselweg. Er könnte als zusätzliche Schutzmaßnahme für die Pflanze dienen, um bei starkem TrStr vermehrt SPM zu bilden. So könnten Ressourcen wie dcSAM bei leichtem und moderatem Stress gespart werden oder wäre eine durch starken TrStr induzierte zusätzliche Stressantwort möglich. Wie bei AtSPDS1/2 (Imai, et al., 2004 b) könnte zwischen den beiden HvSPMS-Genen eine funktionelle Redundanz bestehen, sodass bei Ausfall eines Gens durch Mehrfachbelegung des anderen die Funktion erhalten bleibt. Der Phänotyp würde trotz individueller Regulation unverändert ausgebildet werden (Urano, et al., 2003). Das HvSPMS2-Gen könnte auch

indirekt durch andere durch TrStr ausgelöste Stoffwechselreaktionen induziert werden, was mit dem Calcium-gesteuerten SPM-Signaltransduktionsmechanismus nach Kusano et al.

(Kusano, et al., 2007 a; Kusano, et al., 2007 b) vergleichbar ist. TrStr ist als multifaktorieller Stressor zu verstehen, der in Pflanzen viele Gene induzieren kann (Basu, et al., 2016). Eine

„Nachschaltung“ des HvSPMS2-Gens kann als „Alles-oder-Nichts“-Antwort verstanden werden: Bei Überschreitung eines Grenzwertes wird eine Maximalantwort ausgelöst, um unabhängig von der TrStr-Intensität einen Verteidigungsmechanismus zu durchlaufen, der alle verfügbaren Ressourcen zur Abwehr nutzt.

In allen TrStr-Experimenten war auffällig, dass die rTER-Werte der Kontroll- Pflanzen schwankten. Dies zeigt die hohe Empfindlichkeit des Systems gegenüber TrStr, führte aber teilweise zu hohen statistischen Standardfehlern und nicht signifikanten Unterschieden zwischen gestressten und Kontroll-Pflanzen. In zukünftigen Untersuchungen sollte der WN mittels Tensiometer häufiger bestimmt werden, um die Schwankungen des Wassergehaltes zu minimieren. Die Klimakammersteuerung sollte optimiert werden (effektivere Abschattung), um den systemischen Fehler zu starker Temperaturschwankungen zu mindern. Die erhöhte Temperatur bedeutete für alle Pflanzen einen zusätzlichen Stressor, der zu den Schwankungen der Kontrollpflanzen geführt haben könnte. Dadurch wurden die Quotienten der rTER-Werte verallgemeinert. Zu weit nach oben oder nach unten schwankende rTER-Werte der Kontrollen verminderten oder erhöhten die Quotienten. Ihre statistische Signifikanz nahm ab und die Aussagen in Bezug auf die rTER-Werte der gestressten Pflanzen wurden weniger präzise abgegrenzt. Die qRT-PCR-Schmelzkurven aller untersuchten Proben hatten schmale Peaks, steile Anstiege und streuten wenig. Bei der Messung der Standardkurven wurden nur vereinzelt ausreißende Messwerte erhalten. Die Qualität der Probenpräparationen war demnach hoch und die Schwankungen der rTER-Werte waren nicht auf die Messmethode zurückzuführen. Sie waren eher durch die biologische Varianz des Systems bedingt: Einige Pflanzen reagierten abweichend vom Großteil der Pflanzen einer Gruppe auf die Inkubationsbedingungen. In anschließenden Untersuchungen ist die Anzahl der Pflanzen aller Gruppen zu erhöhen, um diese biologischen Schwankungen in allen, vornehmlich jedoch in den Kontroll-Gruppen zu minimieren. Dies erhöht auch die statistische Validität der erhobenen Daten. Ausreißer sind so einfacher und statistisch sicherer eliminierbar. Die Erhöhung der Kontrollpflanzengruppen der TrStr-Experimente von 2013 und 2014 führte beispielsweise zur Präzisierung der Ergebnisse: Der Unterschied der rTER-Werte von Kontrollen und gestressten Pflanzen wurde genauer bestimmt. Die Kontrollen waren denselben Inkubationsbedingungen ausgesetzt wie die gestressten Pflanzen. Allerdings führt dies zur Steigerung von Zeit und Kosten, was bei der Experimente-Planung und Gestaltung an Grenzen führt.