HvSPMS-Gen-Promotorenaktivitätsuntersuchungen

 in isolierten, transformierten Gerstenprotoplasten untersucht [2.3.14.4.f/51f]

 upstream- und gDNA-Sequenzen sequenziert

 diese in Zusammenarbeit mit Herrn Ricardo Happek (MLU-Halle Wittenberg, Naturwissenschaftliche Fakultät III, Deutschland) jeweils in selbst konstruierten Vektor, der u.a. fluoreszierende Proteine kodiert, kloniert

 Plasmide in isolierte Hordeum vulgare- Protoplasten transformiert und unter Fluoreszenzlicht betrachtet  Rückschlüsse HvSPMS-Gen-Promotoren-Aktivität gezogen 2.3.14.1. Isolation von Hordeum vulgare gDNA

 Isolation genomischer DNA mit Qiagen^® DNeasy^® Plant Maxi Kit aus 7 das-alten Hordeum vulgare Pflanzen (QIAGEN, 2015)]

 in mit Salzsäure (5 %) und Ethanol (unvergält) gereinigten, sterilisierten Mörser 1 g gefrorenes Pflanzenmaterial in N2 liq und Spatelspitze Quarz/Seesand gemörsert  feinkristallines, mehliges Pulver

 Qiagen-Protokoll ab Schritt 8 nach Herstellerangaben abgearbeitet (QIAGEN, 2015)

 gDNA in 2,5 ml AE-Puffer eluiert, Konzentrationsbestimmung mit Plattenleser NanoQuant Infinite M 200 [2.5.1.2./58], Konzentration lag bei 20,8 ng/µl  Fällung [2.3.2./33], Aufnahme in 800 µl AE-Puffer erneute Bestimmung und Lagerung bei 4 °C

 gDNA-Güte mit 1 µl gDNA auf 0,7 %-igem Agarosegel [2.3.4./35]bestimmt [2.3.4./35], anschließend Genome Walking [2.3.14.2./48]

2.3.14.2. Genome Walking

 verwendete Primer unter 2.1.3./14 aufgeführt; Primerdesign nach GenomeWalker^™ Universal Kit User Manual (Clontech, 2007)

 erster gDNA-Verdau [2.3.14.1./48] über Nacht bei 37 °C nach Herstellerangaben mit EcoRV-Restriktase, Gütebestimmung anhand 0,7 %-igem Agarosegel [Tabelle 70-X/151]

 zweiter gDNA-Verdau nach Herstellerangaben

 erstellte Restriktionsbibliotheken (digestion library, DL]:

DL1 – DraI DL2 – PvuII

DL3 – StuI DL4 – EcoRV

DL5 – PsiI DL6 – SspI

 120 min, bei 37 °C inkubiert, Trennung mit 0,7 %-igem Agarosegel [Tabelle 70-XI f/151], Reinigung nach Herstellerangaben

 Ligation an GenomeWalker^™ Adapter [Abbildung 33/184] bei 16 °C über Nacht

 Genome Walking-Ranger-PCRs [2.3.5.6./41] über Nacht, Lagerung bei 4 °C

 Analyse anhand 1,5 %-igem Agarosegel [Tabelle 70-XIII bis XVI/151]

 Extraktion positiver PCR-Amplifikate [2.3.6./43], keine zusätzlichen PCR-Zyklen

 Ligation der PCR-Fragmente in pGEM^®-T Easy Vektor [2.3.7.1./44]; verschiedene, vom Promega-Protokoll (Promega, 2009) abweichende Ligationsansätze und Temperaturprogramme nötig [Tabelle 34/49]; HvSPMS-Ligationsprogramme verschieden

Verhältnis Programm HvSPMS2 Programm HvSPMS1

Vektor Insert T in °C Zeit Zyklen T in °C Zeit Zyklen

a) 0,5 3,50 37 2 min

50 x 6°-16 1 °C/s

100 x

b) 1,0 1,00 16 5 min 16 1 min

c) 1,0 1,50 16 ∞ 16-37 1 °C/s

d) 1,0 2,00 37 1 min

e) 1,0 3,00 37-16 1 °C/s

f) 1,0 0,37 16 1 min

g) 1,0 0,70 16-8 1 °C/s

h) 1,0 1,86 8 ∞

i) 1,5 2,50

Tabelle 34: Ligationen für Genome Walking, Verhältnis Vektor zu Insert, Temperaturprogramme

anstelle in 2.3.7.1./44 beschriebenen Verhältnisse von Vektor zu Insert wurden unter a-g aufgeführten Verhältnisse in verschiedenen Ligationsansätzen in Abhängigkeit von erfolgreicher Bakterientransformation pipettiert; Temperaturprogramme für optimale Ligationsbedingungen im Mastercycler gradient laufen lassen, Programm HvSPMS2 wich von Programm HvSPMS1 ab (Genome Walking von HvSPMS2 zeitlich vor HvSPMS1)

 Transformation der Ligationsansätze in E. coli XL2-Bakterienkulturen, Ausplattierung auf LB-Agarplatten [2.3.9./46], Inkubation bei 37 °C über Nacht

 Mango-Mix-Kolonie-PCR [2.3.10./46] mit M13-Primern (M13uni [– 21], M13rev [– 29]), über-Nacht-Flüssigkulturen von positiven Transformanden

 Plasmidpräparation [2.3.11./47], Erfolgskontrolle über Restriktionsverdau [2.3.13./47] mit MCS (multiple Klonierungsregion)-Restriktasen des pGEM^®-T Easy Vektors (Promega, 2009) [6.6.2./184]

 Sequenzierung der HvSPMS-Fragmente in mehreren Schritten [2.3.15./52] mit M13-Primern und Primer-Satz Nr. 10 [2.1.3./14] (über online-Portal Eurofins Genomics GmbH, Ebersberg anhand bereits bekannter, im Laufe der Sequenzierung bekannt gewordener Sequenzinformationen editiert; nur von Eurofins Genomics GmbH verwendet)

 HvSPMS-Gen-upstream-Regionen in selbst-konstruierten Vektor kloniert [2.3.14.3./49]

2.3.14.3. Vektorkonstruktion

 Reinigungen mit Promega Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, 2010);

Ligationen mit T4-Ligase, New England Biolabs in Verhältnis von Vektor : Insert = 3 : 1 [2.3.7.2./44]; Transformationsreaktionen mit Elektroschock in elektrisch kompetente E.

coli One Shot^® Top10 [2.3.9.2./46]; Kolonie-PCRs nach Tabelle 29/43 mit Primersatz Nr.

11 [2.1.3./14]; Flüssigkulturen mit TB-Medium (25 µg/ml Kanamycin);

Plasmidpräparationen mit Promega PureYield^™ Plasmid Miniprep System (Promega, 2009); Restriktionsverdau nach 2.3.13./47; Agarose-Gel-Elektrophorese nach 2.3.4./35;

zusätzliche PCRs nach Tabelle 29/43 mit Primersatz Nr. 11 [2.1.3./14];

Dephosphorylierung (New England Biolabs, 2016) mit CIP-Phosphatase (Macherey &

Nagel, 2013); blunt end-Reaktionen (Blunten) mit DNA-Polymerase I, Large (Klenow) Fragment (New England Biolabs, 2016)

 Grundgerüst für selbst konstruierten Vektor: pGreen II (0179)- Vektor (als pGreen-Vektor bezeichnet),Quelle: John Innes Centre, Norwich UK, (Hellens, et al., 2000) und pART7-Vektor (Gleave, 1992)

 Subklonierung mCherry-Kassette des pART7-35S::mCherry_Tocs-Vektors (Quelle:

Ricardo Happeck, MLU-Halle Wittenberg, Naturwissenschaftliche Fakultät III, Deutschland) pGreen-Vektor:

 Restriktionsverdau mit Restriktase NotI pGreen-Vektor geöffnet, aus pART7-35S::mCherry-Tocs-Vektor wurde 35S::mCherry-Tocs-Kassette ausgeschnitten

 Reinigung beider Restriktionsverdaureaktionen, Dephosphorylierung offener pGreen-Vektor und erneute Reinigung; Ligation 35S::mCherry-Tocs-Kassette und offener pGreen-Vektor über Nacht bei 16 °C  pGreen-red-Vektor [6.2.1./153]

 Transformation in E. coli; Erfolgskontrolle über Kolonie-PCR mit Primern 213, 820

 Bestimmung positiver Transformanden via Agarose-Gel-Elektrophorese, Über-Nacht-Flüssigkulturen

 Isolierung amplifizierter pGreen-red-Plasmide am Folgetag; Restriktionsverdau und anschließende Agarose-Gel-Elektrophorese; Erfolgskontrolle anhand Restriktionsverdau-Bandenmuster und zusätzlichen PCRs mit Primern 213 und 214 (spezifisch für pGreen-Vektor), 213 und 820 (spezifisch für mCherry-Kassette) und 334 und 1081 (spezifisch für BASTA-Resistenz-Kassette) [Tabelle 70-XVII/152]

 Subklonierung eYFP-Protein-Kassette des pUBI-AB-mUBI::eYFP-Tnos-Vektors (Quelle:

Ricardo Happeck, MLU-Halle Wittenberg, Naturwissenschaftliche Fakultät III, Deutschland) in pGreen-red-Vektor:

 Restriktionsverdau pGreen-red-Vektor mit Restriktase SalI, aus pUBI-AB-mUBI::eYFP-Tnos-Vektor mit Restriktasen HindIII und NotI eYFP-Tnos-Kassette ausgeschnitten; Erfolgskontrolle über mittels Agarose-Gel-Elektrophorese

 Reinigung Restriktionsverdauansatz, Blunten, erneute Reinigung; Dephosphorylierung pGreen-red-Vektor, Reinigung; Ligation offener pGreen-red-Vektor und ausgeschnittene eYFP-Tnos-Kassette über Nacht bei 16 °C  pGreen-red-yellow-Vektor [6.2.2./154]

 Transformation in E. coli; Erfolgskontrolle mit Kolonie-PCR mit Primern 213 und 214

 Bestimmung positiver Transformanden via Agarose-Gel-Elektrophorese; Über-Nacht-Flüssigkulturen

Isolation amplifizierter pGreen-red-yellow-Plasmide am Folgetag; Restriktionsverdau und anschließende Agarose-Gel-Elektrophorese; Erfolgskontrolle anhand Restriktionsverdau-Bandenmuster [Tabelle 70-XVIII/152]

 Subklonierung Ubiquitin-Promotor aus Mais (mUBI) bzw. HvSPMS-Gen-upstream-Regionen in pGreen-red-yellow-Vektor vor eYFP-Gen:

 Restriktionsverdau: aus pUBI-AB-Vektor [6.2.4./157] mit Restriktasen SacI, SpeI mUBI-Promotor herausgeschnitten; pGreen-red-yellow-Vektor mit Restriktase SpeI vor eYFP-Kassette geöffnet; HvSPMS1-Gen- upstream-Region mit Restriktasen EcoRI, ScaI aus pGEM-T-Easy-HvSPMS1-Plasmid ausgeschnitten

 Reinigung und Blunten Restriktionsverdaureaktionen; Dephosphorylierung offener pGreen-red-yellow-Vektor, Reinigung

 Klonierung HvSPMS2-Gen-upstream-Region aus pGEM-T-Easy-HvSPMS2-Plasmid mittels Phusion Polymerase-PCR [2.3.5.8./43] und Phusion-SPMS2-Primern Primersatz 12 [2.1.3./14]

 Ligation Ubi-Promotor, HvSPMS1-Gen-upstream-Region, PCR-Ansatz HvSPMS2-Gen-upstream-Region für 72 h bei 16 °C in offenen pGreen-red-yellow-Vektor  Vektoren red-mUBI-yellow, red-upHvSPMS1-yellow, und pGreen-red-upHvSPMS2-yellow [6.2.3./155]

 Transformation in E. coli; Erfolgskontrolle via Kolonie-PCR mit Primern 213, 333 (Ubiquitin-Promotor) bzw. 213, Kolo-Primern Primer-Satz 12 (upstream-Regionen HvSPMS2-Gen)

 Bestimmung positiver Transformanden über Agarose-Gel-Elektrophorese; Über-Nacht-Flüssigkulturen, Plasmidisolation am Folgetag; Restriktionsverdau und anschließende Agarose-Gel-Elektrophorese; Erfolgskontrolle anhand [Tabelle 70-XIX bis XXI/152]

 mit Konstrukten (Ubiquitin- und HvSPMS-Konstrukte) transiente Gerstenprotoplasten-Transformation [2.3.14.5./52]

2.3.14.4. Protoplastenisolation

 aus Blättern 14 das- alter Pflanzen

 Blattmaterial in Plasmolyse-Puffer gelegt und in 0,1-0,5 cm breite Streifen geschnitten, geschnittenes Material umgehend in Cellulase-Macerozym-Gemisch überführt

 Inkubation Blattmaterial-Enzymgemisch 30 min bei RT unter vermindertem Luftdruck (Exsikkator); anschließend langsame Belüftung Vakuumbehälter; an Gefäßwänden klebendes Pflanzenmaterial wieder in das Gemisch verbracht; Inkubation 210 min bei RT und 40 min^-1

 Blattmaterial-Enzymgemisch vorsichtig und langsam durch mit W5-Lösung getränktes feinmaschiges Netz gegossen; 5 ml W5-Lösung vorsichtig auf Filtrat pipettiert und gemischt

 Zentrifugation 5 min bei RT und 100 g; Überstand mit abgenommen und verworfen

 Protoplasten in 3 ml W5-Lösung suspendiert; bei 4 °C in Fuchs-Rosenthal-Kammergezählt; Verdünnung Protoplasten-W5-Lösung-Gemisch auf Konzentration von 2 × 10⁶ Protoplasten pro Milliliter in Mannitol-Magnesium-Lösung

 anschließend transiente Protoplastentransformation [2.3.14.5./52]

2.3.14.5. transiente Protoplastentransformation

 Elektroshock-Transformation [2.3.9.2./46] E. coli One Shot^® Top10-Bakterienkulturen mit Vektorkonstrukt-Plasmiden [2.3.14.3./49]; Inkubation auf Kanamycin-haltigen Agarplatten (25 µg/ml) 8-10 h bei 37 °C; 250 ml-Über-Nacht-Kultur angesetzt

 Plasmidisolation mit NucleoBond^®Xtra Midi Kit (Macherey & Nagel, 2013) nach Midi-Präparation-Präparation am Folgetag

 10 µg Plasmid mit 100 µl Protoplasten-W5-Lösung-Gemisch versetzt, vorsichtig gemischt; Zugabe 110 µl PEG-CMS-Lösung, vorsichtig gemischt

 Inkubation 20 min bei 23 °C, Zugabe von 1'000 µl W5-Lösung, vorsichtig gemischt

 Zentrifugation 2 min bei RT, 100 g; Überstand abgenommen; Pellet in 750 µl Proto-plasteninkubationsmedium suspendiert, in Petrischale pipettiert, mit Parafilm verschlossen

 Auswertung via Fluoreszenzmikroskopie [2.3.14.6./52]

2.3.14.6. Fluoreszenzmikroskopie

 Erfolgskontrolle Gerstenprotoplastentransformation [2.3.14.5./52], Aktivitätsprüfung HvSPMS-Gen-upstream-Regionen

 Detektion mCherry-Protein: Anregung Protoplasten bei 550 ≤ λ_ex ≤ 580 nm (gelbes Lichtspektrum); Emissionsmessung bei 590 ≤ λ_em ≤ 650 nm (orangerotes Lichtspektrum)

 Detektion eYFP-Protein: Anregung Protoplasten bei 450 ≤ λ_ex ≤ 490 nm (blaues Lichtspektrum); Emissionsmessung bei 500 ≤ λ_em ≤ 550 nm (grünes Lichtspektrum)

 Fluoreszenzmikroskopie und Nomarski Differentialinterferenzkontrastmethode mit Axio-Observer Z.1 Mikroskop (Filtersätze 38 HE und 31) [2.1.5./17], AxioVision Software durchgeführt, 100-fache Vergrößerung

 interne Kontrolle der Transformationsexperimente = Ubiquitinpromotorkonstrukt: rote Fluoreszenz der mit diesem Plasmidkonstrukt transformierten Protoplasten nachweisbar

 Transformation erfolgreich

Im Dokument Einfluss von Trockenstress auf Polyamine und Sperminsynthasen in Gerste (Hordeum vulgare) (Seite 63-67)