5 Untersuchung von CNI-1493 und seiner Derivate
5.4 Untersuchung der Hydrolyse von CNI-1493 2
111
112
Zweck ungeeignet, da nur ein viel zu breiter Peak beim Eluieren des CNI-1493 2 erhalten wurde. Als Drittes wurde ein 10 mM Ammoniumformiat-Puffer mit pH 3.0 erprobt. In diesem Puffer sollten die Guanidinogruppen vollständig protoniert vorliegen und es zu präzisen Peaks kommen. Die Tendenz war gut, aber die Puffer-Konzentration noch nicht hoch genug. Erst mit 100 mM Ammoniumformiat-Puffer (pH 3.0) wurden reproduzierbar gute Ergebnisse erhalten, wobei CNI-1493 immer ein minimales Tailing zeigte. Als Säule wurde eine Nucleodur® C18 Gravity (EC 125/4.6, 5 µm) der Firma Macherey-Nagel benutzt. Das Kieselgel ist vollständig Oktadecyl-modifiziert und bietet durch die hohe Basendesaktivierung eine gute Stabilität gegenüber basischen, Stickstoffhaltigen Analyten wie z. B. 2.
Nachdem eine geeignete Säule und eine geeignete mobile Phase gefunden worden waren, wurde der Gradient zur Trennung optimiert. Ein Gradient von 5% auf 44%
Acetonitril über 12 Minuten bei einer Flussrate von 1.3 mL/min war zur Trennung von AZT und CNI-1493 2 in scharfe Peaks am besten geeignet. Wie zuvor erwähnt, wurde aber bei 2 stets ein minimales Tailing beobachtet. Mit der Methode waren schließlich alle benötigten Bausteine für eine erfolgreiche Analytik der Hydrolyse von CNI-1493 vorhanden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden im folgenden Kapitel vorgestellt.
5.4.2 Hydrolyse von CNI-1493 2
Es wurde eine 5 µM CNI-1493 Stammlösung in DMSO angesetzt, bei -26 °C gelagert und zur Entnahme der Aliquote jeweils wieder aufgetaut. Die einzelnen Hydrolyselösungen enthielten 0.1 µM 2 bzw. 0.2 µM AZT. In Tabelle 15 sind die getesteten Puffer aufgelistet (s. Kap. 9.3, S. 171). Als Simulation für die biochemischen Assays in Zellkultur wurde RPMI-Medium verwendet (Nr. 3). Zeile 4 entsprach dem Puffer, der von Hilgenfeld et al. für die Kristallisationsexperimente verwendet wurde.[54] Zusammen mit dem Glycin-Puffer, der in den in vitro DHS-Inhibitions-Assays verwendet wurde (Zeile 5), waren die biochemischen Testbedingungen komplett (s. Kap. 5.3, S. 103ff). Um die CNI-Hydrolyse bei verschiedenen pH-Werten, aber in dem gleichen Puffer zu untersuchen, wurde ein Phosphatpuffer verwendet. Die Inkubation fand bei Raumtemperatur und bei 37 °C statt.
113
Tabelle 15: Pufferbedingungen zur Untersuchung der Hydrolyse von CNI-1493
Nr. Puffer pH-Wert Nr. Puffer pH-Wert
1 DMSO - 8 PBSd 6.0
2 Wasser 7.0 9 PBSd 6.8
3 RPMI-1640a 7.2 10 PBSd 7.5
4 Trisb 8.5 11 PBSd 8.5
5 Glycinc 9.0 12 PBSd 9.0
6 PBSd 1.9 13 PBSd 11.0
7 PBSd 4.0
a RPMI-1640/Hitze inaktiviertes FCS (10%), 37 °C; b 100 mM Tris, 63% 2-Methyl-2,4-pentandiol, 3 mM NAD+, Rt; c 300 mM Glycin, 37 °C; d 50 mM Phosphatpuffer, 37 °C.
Es zeigte sich, dass für CNI-1493 im Sauren (pH 1.9-6.8) nach 120 h noch keinerlei Hydrolyse detektiert werden konnte. Unter neutralen bis basischen Bedingungen dagegen wurde eine schrittweise Hydrolyse detektiert. Unabhängig vom eingesetzten Puffer waren die Hydrolyseprodukte lipophiler als 2, sie eluierten stets bei späteren Retentionszeiten an der RP-HPLC (s. Abb. 109 und Abb. 110).
Da die Retentionszeiten der detektierten Hydrolyseprodukte in Abhängigkeit des Inkubationspuffers differierten, wurde zunächst vermutet, dass es sich je nach Puffer um andere Produkte handeln müsste. Um diesen Sachverhalt aufzuklären wurden LC-MS Messungen durchgeführt. Die Peaks der Hydrolyseprodukte ließen sich mittels LC-MS charakterisieren und es zeigte sich, dass diese unabhängig vom Inkubationspuffer identisch waren (vgl. Abb. 111, S. 115).
Über AZT als internem Standard konnte eine relative Bestimmung der Halbwertszeit in den entsprechenden Puffern durchgeführt werden. Es wurden aber nur Einfachbestimmungen vorgenommen, so dass die Halbwertszeiten keine absoluten Werte darstellen. Außerdem wurden in manchen Fällen keine Basislinien-getrennten Peaks erhalten. Mit einer Halbwertszeit von ca. 140 h verlief die Hydrolyse in reinem DMSO bei 37 °C langsamer als in der DMSO/Wasser 1:1 Mischung (ca. 87 h).
Exemplarisch sind die Chromatogramme der Hydrolyse von 2 in DMSO/Wasser in Abb. 109 dargestellt. Die Abnahme des Peaks von CNI-1493 über die Zeit ist deutlich zu erkennen.
114
Abb. 109: Chromatogramme der Hydrolyse von 2 in DMSO/Wasser bei 37 °C
Zusammenfassend führten die Hydrolyseuntersuchungen in basischem PBS-Puffer zu ähnlichen Chromatogrammen, nur verlief die Hydrolyse mit Halbwertszeiten bis mindestens 45 h schneller, je höher der pH-Wert des Puffers war. Auch hier war kein signifikanter Unterschied zwischen der Inkubation bei Rt und bei 37 °C zu erkennen (Puffer-Nr. 10-13, Tabelle 15, S. 113).
Interessant war, dass die Retentionszeiten der Hydrolyseprodukte in Glycin-Puffer weiter auseinander lagen als bei der Inkubation in DMSO/Wasser oder PBS-Puffer (s. Abb. 110). Zusätzlich scheint die Halbwertszeit nicht nur vom pH-Wert sondern auch vom verwendeten Puffer abhängig zu sein. Für den im in vitro DHS-Inhibitions-Assay verwendeten Puffer ergab sich eine ungefähre Halbwertszeit von 139 Stunden. Dieser Wert ist relativ groß im Vergleich zu der Halbwertszeit von 2 im PBS-Puffer bei pH 9.0.
Abb. 110: Chromatogramme der CNI-1493 Hydrolyse in 300 mM Glycin-Puffer (pH 9.0) bei 37 °C
115
In diesen Chromatogrammen erkennt man deutlich die Bildung von drei lipophileren Hydrolyseprodukten. Über HPLC gekoppelte ESI-Massenspektrometrie konnten zwei der Hydrolyseprodukte identifiziert werden: Mit einer Retentionszeit von tR = 8.85 min handelt es sich um das Monoketon und mit tR = 10.35 min um das Diketon (vgl. Abb.
111). Aufgrund der massenspektrometrischen Analyse konnte nicht genau gesagt werden, welche Iminbindungen sukzessive hydrolysiert wurden. Hierzu müssten MS-MS-Untersuchungen durchgeführt werden, bei denen die Fragmente der Ionen untersucht werden. Das dritte Hydrolyseprodukt wurde nicht per LC-MS zugeordnet, aber mit einer Retentionszeit von 12.65 Minuten sollte es sich um das Triketon handeln.
Abb. 111: Schematische Darstellung der Hydrolyse von CNI-1493 2
Bei Einsatz des ebenfalls basischen Tris-Puffers, der für die Kristallisation eingesetzt wurde, konnte hingegen eine sehr schnelle Hydrolyse von 2 detektiert werden.
Problematisch war die hohe Viskosität des 2-Methyl-2,4-pentandiols sowie der 3 mM NAD, die als Zusätze im Kristallisationspuffer enthalten waren. Dadurch kam es zu einem starken Tailing der Verbindungen und dem dominanten Peak für das NAD.
Trotzdem war deutlich zu erkennen, dass schon nach 3.5 Tagen nahezu kein CNI-1493 mehr vorhanden war. Dadurch, dass die Inkubation der kristallisierten DHS mit CNI-1493 in dem gleichen Tris-Puffer über 48 h durchgeführt wurde, lässt sich die Beobachtung des Aminoguanidin-Fragments in der Kristallstruktur mit den durchgeführten Hydrolysestudien erklären.
Die Untersuchungen der Hydrolyse im RPMI-Medium ergaben, dass CNI-1493 mindestens über vier Tage keinerlei Hydrolyse zeigte. Somit ist die Stabilität von CNI-1493 während der biochemischen Tests in Zellkultur gegeben. Abschließend
116
wurde noch festgestellt, dass die stetige Wiederholung von Einfrieren/Auftauen über die Zeit ebenfalls zur Hydrolyse von 2 führte. Jedoch sind damit lange Zeiträume über ca. 6 Monate gemeint, abhängig von der Häufigkeit des Auftauens. Es ist also ratsam, die Stammlösung zukünftig direkt zu aliquotieren.