9 Experimenteller Teil
9.1 Allgemeines
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1.) puriss. absolut, über Molsieb (0.4 nm), H2O:
≤ 100 ppm (Sigma-Aldrich 40248).
1,2-Dimethoxyethan: C4H10O2 [90.12 g/mol]; Sdp.: 84 °C; ρ = 0.87 g/cm3
1.) technische Qualität; unter Stickstoffatmosphäre für mehrere Tage über Kalium zum Rückfluss erhitzt, anschließend destilliert und über Molsieb 0.4 nm aufbewahrt.
1,4-Dioxan: C4H8O2 [88.11 g/mol]; Sdp.: 101 °C; ρ = 1.03 g/cm3
1.) technische Qualität; unter Stickstoffatmosphäre für mehrere Tage über Kalium zum Rückfluss erhitzt, anschließend destilliert und über Molsieb 0.4 nm aufbewahrt.
Essigsäureethylester: C4H8O2 [88.11 g/mol]; Sdp.: 77 °C; ρ = 0.90 g/cm3
1.) technische Qualität; über Calciumchlorid getrocknet und bei Normaldruck destilliert.
Methanol: CH3OH [32.04 g/mol]; Sdp.: 64 °C; ρ = 0.79 g/cm3 1.) technische Qualität; bei Normaldruck destilliert.
2.) puriss. Absolut, über Molsieb (0.4 nm), H2O:
≤ 100 ppm; (Sigma-Aldrich 65542).
N-Methyl-2-pyrrolidon: C5H9NO [99.13 g/mol]; Sdp.: 202 °C; ρ = 1.03 g/cm3
1.) technische Qualität; unter Stickstoffatmosphäre für mehrere Tage über Calciumhydrid zum Rückfluss erhitzt, anschließend destilliert.
Petrolether (50-70):
1.) technische Qualität, bei Normaldruck destilliert.
Pyridin: C5H5N [79.10 g/mol]; Sdp.: 115 °C; ρ = 0.98 g/cm3
1.) Extra trocken, AcroSeal®, über Molsieb (0.4 nm), H2O: ≤ 50 ppm; (Acros Nr. 364420025).
Tetrahydrofuran: C4H8O [72.11 g/mol]; Sdp.: 65-66 °C; ρ = 0.89 g/cm3
1.) technische Qualität; unter Stickstoffatmosphäre für mehrere Tage über Kalium zum Rückfluss erhitzt,
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anschließend destilliert und über Molsieb 0.4 nm aufbewahrt.
Triethylamin: C6H15N [101.19 g/mol]; Sdp.: 89 °C; ρ = 0.72 g/cm3
1.) technische Qualität; unter Stickstoffatmosphäre für mehrere Tage über Natrium zum Rückfluss erhitzt, anschließend destilliert und über Molsieb 0.4 nm aufbewahrt.
p-Xylol: C8H10 [106.17 g/mol]; Sdp.: 138 °C; ρ = 0.86 g/cm3 1.) zur Synthese; (Merck 808691).
9.1.3 Puffer für die HPLC
Ammoniumformiat-Puffer pH = 3.0 (CNI-1493 Hydrolyse): Es wurden 6.30 g (100 mmol) Ammoniumformiat in ca. 900 mL Reinstwasser gelöst, mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 3.0 eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL aufgefüllt.
TEAA-Puffer pH = 6.9 (Trennung der Oligonucleotide): Es wurden 5.88 mL Eisessig und 10.12 mL Triethylamin in ca. 900 mL Reinstwasser gelöst, auf einen pH-Wert von 6.9 eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL aufgefüllt.
9.1.4 Chromatographie
Dünnschichtchromatographie (DC)
Es wurden mit Kieselgel (+ Fluoreszenzindikator) beschichtete Aluminiumfolien (Merck Nr. 5554; Schichtdicke 0.2 mm und Macherey-Nagel ALUGRAM® Xtra SIL G/UV254 Nr. 818333) verwendet. Die Laufstrecke betrug 5-10 cm. Alle Rf-Werte wurden bei Kammersättigung ermittelt. Die Detektion der UV-aktiven Verbindungen erfolgte mit einer UV-Lampe bei Wellenlängen von 254 nm und 366 nm. Als Färbereagenz wurde ein Gemisch aus p-Methoxybenzaldehyd (0.7 mL), Ethanol (99.8%, 27 mL), konz. Schwefelsäure (1.0 mL) und Essigsäure (0.3 mL) verwendet.
Zur Detektion nicht-UV-aktiver Amine wurde ein Ninhydrin-Färbereagenz verwendet.
Zirkuläre, präparative Dünnschichtchromatographie (Chromatotron)
Mit einem Chromatotron der Firma Harrison Research, Modell 7924 T, wurden Substanzgemische mit Rohausbeuten von bis zu 4 g getrennt. Als Trennmittel diente
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gipshaltiges Kieselgel 60 PF254 (Merck Nr. 7749) in Schichtdicken von 1, 2 und 4 mm auf Glasplatten (Durchmesser: 20 cm). Die Detektion der UV-aktiven Verbindungen erfolgte mit einer UV-Lampe bei einer Wellenlänge von 254 nm und 366 nm.
Präparative Säulenchromatographie
Für säulenchromatographische Trennungen wurde Kieselgel 60 der Firma Macherey-Nagel (0.040-0.063, 230-400 mesh ASTM) verwendet. Es wurden stets destillierte Lösungsmittel verwendet.
Umkehrphasenchromatographie
Für die Säulenchromatographie an einer Umkehrphase wurde LiChroprep RP-18 (40-63 µm) der Firma Merck sowie RP-Kieselgel C18 der Firma Macherey-Nagel (100-50 Polygoprep) verwendet.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Für die CNI-1493 Hydrolyse:
Software: EZ Chrom Elite
System: VWR-Hitachi LaChromElite
Pumpe: VWR-Hitachi L-2130
Automatischer Probenwechsler: VWR-Hitachi L-2200 Dioden Array Detektor: VWR-Hitachi L-2455
Säule 1: EcoCart 125-3 LiChrospher® 100 RP-18e (5 µm) von Merck Säule 2: Nucleodur® C18 Gravity (EC 125/4.6, 5 µm) von Macherey-Nagel Methode RP-18 mit Ammoniumformiat-Puffer:
Acetonitril-Gradient von 5-44% in Ammoniumformiat-Puffer bis 12 min, dann isokratisch 95% Wasser für 5 min, 10 min 95% Acetonitril isokratisch und abschließend 95% Puffer für 10 Minuten. Flussraten: Merck-Säule 0.5 mL/min und Gravity 1.3 mL/min. UV-Detektion bei 264 nm.
Für die CNI-1493 Hydrolyse per LC-MS:
Software: Agilent MassHunter
Massenspektrometer: Agilent 6224 ESI-TOF
HPLC: Agilent HPLC 1200
Säule: Extend-C18 (EC 50/2.1, 1.8 µm) von Agilent
167 Methode RP-18 mit Ammoniumformiat-Puffer:
Acetonitril-Gradient von 5-44% in Ammoniumformiat-Puffer bis 12 min, in einer min 44-95% Acetonitril, dann isokratisch 95% Acetonitril für 5 min und abschließend 95-5% Acetonitril für 2 Minuten. Flussraten: 0.5 mL/min. UV-Detektion bei 264 nm.
Für die Oligonucleotide:
Software: Chromatography Data Station Software HPLC System Manager Version 3.1.1.
Interface: Merck-Hitachi Model L-7000
Pumpe: Merck-Hitachi Model L-7100
Automatischer Probenwechsler: Merck-Hitachi Model L-7200 Dioden Array Detektor: Merck-Hitachi Model L-7455
Säule 1: EcoCart 125-3 LiChrospher® 100 RP-18e (5 µm) von Merck Säule 2: Nucleodur® C18 Gravity (EC 125/3, 5 µm) von Macherey-Nagel Methode RP-18 mit TEAA-Puffer:
Acetonitril-Gradient von 5-23% in TEAA-Puffer bis 55 min, dann isokratisch 95%
Wasser für 5 min, 10 min 95% Acetonitril isokratisch und abschließend 95% Puffer für 10 Minuten. Flussraten: 0.5 mL/min (Säule 1) und 0.56 mL/min (Säule 2).
9.1.5 Geräte
Kernresonanzspektroskopie (NMR)
Die NMR-Spektren wurden in der spektroskopischen Abteilung des Instituts für organische Chemie der Universität Hamburg auf Geräten der Firma Bruker aufgenommen.
1H-NMR: Bruker AMX 400 (400 MHz), Bruker AV 400 (400 MHz), Bruker DMX 500 (500 MHz). Die Standardisierung erfolgte gegen CDCl3 (δ = 7.26 ppm), Benzol-d6
(7.16 ppm), DMSO-d6 (δ = 2.50 ppm) oder D2O (δ = 4.79 ppm). Die Aufnahmen erfolgten über einen Messbereich von 0 bis 14 ppm.
13C-NMR: Bruker AMX 400 (101 MHz), Bruker AV 400 (101 MHz), Bruker DMX 500 (125 MHz). Die Standardisierung erfolgte gegen CDCl3 (δ = 77.16 ppm), Benzol-d6
(128.0 ppm) oder DMSO-d6 (δ = 39.52 ppm). Die in D2O gemessenen 13 C-NMR-Spektren wurden nicht kalibriert. Die Aufnahmen erfolgten über einen Messbereich von 0 bis 200 ppm.
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31P-NMR: Bruker AMX 400 (162 MHz), Bruker AV 400 (162 MHz), Bruker DMX 500 (202 MHz). Die Verschiebungen der 31P-NMR-Signale werden gegen einen externen Standard von 85%-iger Phosphorsäure angegeben.
Infrarotspektroskopie (IR)
Die IR-Spektren wurden an einem Bruker Alpha-P IR-Spektrometer bei Raumtemperatur in einem Messbereich von 400 - 4000 cm-1 aufgenommen. Falls nicht anders angegeben, erfolgte die Messung der Proben in Substanz. Als Messmethode wurde die attenuated total reflexion (ATR) verwendet.
UV-Spektrometer
Die UV-Spektren wurden an einem UV-Spektralphotometer (CARY 1E) der Firma Varian aufgenommen.
Massenspektrometrie (MS)
Die Massenspektren wurden in der massenspektrometrischen Abteilung des Departments Chemie der Universität Hamburg aufgenommen.
Die EI-Massensprektren wurden mit einem doppelt-fokussierenden VG Analytical VG/70-250S-Spektrometer aufgenommen.
Die (HR-)FAB-Massenspektren wurden mit einem doppelt-fokussierenden Spektrometer VG/70-250F der Firma VG Analytical gemessen. Als Matrix wurde m-Nitrobenzylalkohol und als Stoßgas Xenon verwendet.
Die (HR-)ESI-Massenspektren wurden entweder mit einem Finnigan ThermoQuest MAT 95 XL Spektrometer oder einem Agilent Technologies ESI-TOF 6224 Spektrometer gemessen.
Die MALDI-Massenspektren wurden auf einem Bruker UltrafleXtreme Smartbeam II Laser gemessen. Als Matrix wurden DHB oder THAP verwendet.
Gefriertrocknung
Zum Gefriertrocknen wässriger Lösungen wurde eine Christ-Alpha 2-4 Gefrier-trocknungsanlage verwendet.
Thermomixer
Die Abspaltung vom Träger wurde in einem Eppendorf Thermomixer, Modell 5436, bei 45 °C durchgeführt.
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Für chemische Reaktionen unter Mikrowelleneinstrahlung wurde eine Mikrowelle CEM Discover® LabMate der Firma CEM Corp. verwendet.
Circular Dichroismus
Die Messungen des Circular Dichroismus der Oligonucleotide wurden an einem CD Instrument Model 215 der Firma AVIV durchgeführt.
DNA Synthesizer
Die Synthese der Oligonucleotide erfolgte entweder auf einem Applied Biosystems RNA/DNA-Synthesizer 394 oder mit einem H-8-DNA-Synthesizer der Firma K&A Laborgeräte. Die Synthesen wurden dabei nach der Phosphoramidit-Methode durchgeführt.
Nanodrop
Die Konzentrationsbestimmung der Oligonucleotide wurde mit Hilfe eines Thermo Scientific Nanodrop durchgeführt.
Speed-Vac-Probenkonzentrator
Die Trocknung der Oligonucleotide wurde mit Hilfe eines Speed-Vac-Probenkonzentrators, einer Zentrifuge mit integrierter Membranpumpe, der Firma Eppendorf durchgeführt.