Ubiquitin‐proteasome system

1. Introduction 

Protein  function,  localization  and  stability  are  regulated  by  posttranslational  modifications  which involve for example small chemical groups such as acetyl‐, methyl‐ or phosphate moieties,  or larger groups serving as membrane anchors such as palmitoyl‐ or myristoyl groups (Han and  Martinage, 1992; Magee and Courtneidge, 1985). With the discovery of the protein ubiquitin and  its ability to serve as posttranslational modification in the 1980s, a new chapter of the functions  of  these  modifications  has  begun.  Ubiquitin  was  found  to  target  proteins  for  proteasomal  degradation  thereby  offering  the  cell  a  second  major  pathway  to  regulate  protein  levels  in  addition  to  lysosomal  degradation.  In  the  meantime,  several  proteins  with  high  structural  similarity  to  ubiquitin  were  identified  most  of  which  act  as  posttranslational  modifiers  controlling various cellular functions (Hershko and Ciechanover, 1998; Kerscher et al., 2006).  

1.1 Ubiquitin‐proteasome system 

Ubiquitin is a small protein of 76 aa and 8.6 kDa which is highly conserved among eukaryotic  organisms  (Hershko  and  Ciechanover,  1998).  Structurally,  ubiquitin  is  characterized  by  a  globular domain with a β‐grasp fold and a flexible C terminus (Figures 1 and 4B) (Vijay‐Kumar  et al., 1987). 

Figure 1. Crystal structure of ubiquitin revealing the characteristic β­grasp fold  

Ribbon representation of human ubiquitin (protein data base 1UBQ; modeled with Pymol). The structure of ubiquitin  is  characterized  by  four  antiparallel  β‐sheets  grasping  an  α‐helix.  The  C  terminus  of  ubiquitin  protrudes  from  the  globular domain (Vijay‐Kumar et al., 1987). 

C

N

1.1.1 Ubiquitin‐conjugation cascade

In  humans,  expression  of  ubiquitin  from  one  of  the  four  different  genes  first  leads  to  the  formation of an inactive precursor protein (Baker and Board, 1987; Lund et al., 1985; Wiborg et  al., 1985). Being rapidly processed by ubiquitin‐specific proteases, the functionally important C‐

terminal double glycine motif of ubiquitin is exposed (Wilkinson, 1997).  

In  an  enzymatic  cascade,  ubiquitin  is  covalently  attached  to  other  proteins  via  its  C  terminus  (“ubiquitination”).  Ubiquitination  occurs  through  several  consecutive  steps  catalyzed  by  three  (or four) different classes of enzymes: ubiquitin‐activating enzymes (E1), ubiquitin‐conjugating  enzymes  (E2)  and  ubiquitin  ligases  (E3)  (Figure  2).  In  some  cases,  an  E4  enzyme  may  be  required for the formation of ubiquitin chains (Hershko and Ciechanover, 1998; Hoppe, 2005).  

In  a  first  step,  the  carboxyl  group  of  the  C‐terminal  glycine  of  ubiquitin  forms  a  high  energy  thioester linkage with an active site cysteine residue of one of two E1 enzymes, UBA1 or UBA6. 

This  step  is  ATP‐dependent  and  involves  the  formation  of  a  ubiquitin  adenylate  intermediate  (Jin  et  al.,  2007;  Pelzer  et  al.,  2007;  Pickart,  2001).  The  E2  is  then  able  to  accept  activated  ubiquitin from its cognate E1, forming a thioester linkage. In the last step, which in most cases  requires  the  presence  of  an  E3,  ubiquitin  is  transferred  to  the  lysine  residue  of  a  substrate  protein by the formation of an isopeptide bond (Pickart, 2001) (Figure 2). An asparagine residue  in the conserved HPNI/V motif next to the catalytic cysteine of the E2 enzyme plays a crucial role  for accomplishing this transfer, as it might be important for oxyanion intermediate stabilization  during lysine attack (Wu et al., 2003b). 

Structural and functional analyses indicate that E3s consist of at least two functional domains: 

one  domain  (i.e.  RING/RING‐like  or  HECT)  is  interacting  with  the  cognate  E2  while  the  other  mediates the specific interaction with the substrate, thereby conferring substrate specificity on  the whole conjugation cascade. Depending on their mode of action, E3 ligases can be divided into  two major classes: HECT and RING/RING‐like ligases (Metzger et al., 2012). HECT ligases contain  a HECT (Homologous to E6AP Carboxyl Terminus) domain which consists of an N‐terminal and a  C‐terminal  lobe.  The  N‐terminal  lobe  is  necessary  for  the  interaction  with  the  E2  enzyme,  whereas the C‐terminal lobe contains a catalytic cysteine which forms a thioester linkage with  ubiquitin before transferring it to the substrate (Huang et al., 1999).  

Figure 2. Ubiquitin­conjugation cascade 

Ubiquitin is first activated by the E1 and then transferred to one of a number of E2 enzymes. RING E3 ligases facilitate  the conjugation of ubiquitin to the substrate by acting as adaptors between E2s and substrates. In contrast, HECT E3  ligases form thioester bonds with ubiquitin and subsequently transfer it to the substrate. By repeating these steps, the  substrate can be modified with several ubiquitin moieties (modified from (Di Fiore et al., 2003)).  

Being encoded by more than 600 genes in mammals, RING ligases represent the largest family of  E3 ligases (Li et al., 2008). This type of ligase is characterized by a RING (Really Interesting New  Gene) domain containing the consensus motif C‐X2‐C‐X(9‐39)‐C‐X(1‐3)‐H‐X(2‐3)‐C/H‐X2‐C‐X(4‐

48)‐C‐X2–C (X stands for any aa), which is stabilized by two zinc ions (Lovering et al., 1993). By  bringing  the  E2  enzyme  and  the  substrate  into  close  proximity,  RING  ligases  allow  a  direct  transfer of ubiquitin from the E2 to the substrate.  

The family of RING ligases comprises ligases that function as monomer, homo‐ or heterodimer  or as large multi‐subunit complexes.  Most of the known RING ligases possess intrinsic E3 ligase  activity,  but  there  are  also  RING  domain  containing  proteins  that  do  not  show  activity  by  themselves,  e.g.  Bard1,  Bmi1  and  HdmX.  Heterodimerization  of  these  E3  ligases  with  another  RING ligase (Brca1, Ring1B and Hdm2, respectively), which involves the interaction of the RING  domains, leads to the stimulation of ligase activity of the latter (Hashizume et al., 2001; Linares  et  al.,  2003;  Wang  et  al.,  2004).  Moreover,  other  RING  E3  ligases  like  RNF4  or  TRAF6  form 

ATP AMP+PPi

homodimers to execute their function (Liew et al., 2010; Yin et al., 2009). Recent data about the  mechanism of ubiquitin transfer by RNF4 sheds light on why dimerization is necessary for RING  ubiquitin ligase activity. Dimerization of the RING domains facilitates the interaction with both  components of the ubiquitin‐charged E2 at the same time: one monomer binds to ubiquitin and  the other one to the E2. By altering the conformation of the active site of the E2, the E2‐ubiquitin  thioester bond is then activated and ubiquitin can be transferred to the substrate (Plechanovova  et al., 2011; Plechanovova et al., 2012).  

Being  composed  of  multiple  subunits,  the  APC/C  complex  and  cullin‐RING  ligases  such  as  SCF  form  an  additional  type  of  RING  E3  ligases.  APC/C,  a  complex  consisting  of  at  least  twelve  subunits including the RING domain containing protein APC11, plays a major role in cell cycle  regulation,  especially  in  mitotic  progression.  Dependent  on  the  substrate  adaptor  bound,  a  specific  set  of  substrates  is  recognized,  ubiquitinated  and  degraded  by  the  proteasome  (reviewed  in  (Peters,  2006)).  The  SCF  complex  belongs  to  the  largest  family  of  ubiquitin  E3  ligases  known,  the  cullin‐RING  ligases  (see  chapter  1.3.1.1).  It  consists  of  Cullin1  as  scaffold  protein,  the  RING  ligase  RBX1,  Skp1  as  adaptor  protein  and  an  exchangeable  F‐box  protein  recognizing a specific substrate. Not only cell cycle inhibitors like p21 or p27, but also oncogenic  proteins such as Cyclin E or c‐Myc turned out to be substrates for SCF complexes, underlining its  important role in controlling the cell cycle (summarized in (Kitagawa et al., 2009)).  

1.1.2 Modes of ubiquitination 

In most cases, ubiquitination of substrates occurs via isopeptide bond formation between the C‐

terminal glycine residue of ubiquitin and the  ‐amino group of a lysine residue in the substrate. 

Furthermore, there are few publications showing that serine, threonine and cysteine residues as  well as the N‐terminal amino group of some proteins are used for the attachment of ubiquitin  (Cadwell and Coscoy, 2005; Ciechanover and Ben‐Saadon, 2004; Shimizu et al., 2010; Wang et al.,  2007b).  

In addition to mono‐ or multiubiquitination where single ubiquitin moieties are conjugated to  one or several distinct residues in the substrate protein, respectively, ubiquitin is also capable of  forming “chains” (polyubiquitination) (Figure 3). Monoubiquitination was found to be involved  in DNA damage response and endocytosis (reviewed in (Hicke, 2001)). For instance, Rad6‐ and  Rad18‐dependent  ubiquitination  of  the  sliding  clamp  PCNA  leads  to  the  recruitment  of  translesion  synthesis  polymerases  that  are  crucial  for  inducing  the  DNA  damage  tolerance  pathway  (Hoege  et  al.,  2002;  Kannouche  et  al.,  2004).  Moreover,  multiubiquitination  plays  a  particular role in the internalization and lysosomal degradation of plasma membrane receptors,  e.g. receptor tyrosine kinases (Haglund et al., 2003). 

Each of the seven internal lysine residues of ubiquitin (K6, K11, K27, K29, K33, K48 and K63)  can  be  used  for  isopeptide  bond  formation  with  the  C‐terminal  carboxyl  group  of  another  ubiquitin  moiety  and  hence,  for  the  formation  of  polyubiquitin  chains  (Figure  3).  Best  characterized and most abundant are K11‐, K48‐ and K63‐linked chains (Ye and Rape, 2009). As  an  example,  the  E3  ligase  complex  APC/C  triggers  degradation  of  its  mitotic  substrates  via  formation  of  K11‐linked  ubiquitin  chains  (Jin  et  al.,  2008).  Furthermore,  the  ubiquitin‐

conjugating  enzyme  Ubc6  which  is  involved  in  ER‐associated  degradation  (ERAD),  a  protein  quality control system mainly localized in the ER membrane, is ubiquitinated and degraded via  K11‐linkage  of  ubiquitin  in  yeast  (Xu  et  al.,  2009).  Nonetheless,  K48‐linked  chains  are  a  more  common  signal  to  target  proteins  for  proteasomal  degradation  (Chau  et  al.,  1989).  For  a  long  time  it  was  believed  that  a  minimal  chain  length  of  four  ubiquitin  moieties  linked  via  K48  is  absolutely  required  for  the  recognition  by  the  proteasome  (Thrower  et  al.,  2000).  This  hypothesis  is  contradicted  by  recent  studies  indicating  that  monoubiquitinated  or  multiubiquitinated  proteins  like  PAX3  or  p105,  respectively,  can  also  be  recognized  and  degraded by the proteasome (Boutet et al., 2007; Kravtsova‐Ivantsiv et al., 2009; Shabek et al.,  2012). In contrast to K11‐ and K48‐chains, K63‐linked chains are relevant for a variety of non‐

proteolytic cellular processes like endocytosis, DNA repair or activation of kinases (Deng et al.,  2000;  Duncan  et  al.,  2006;  Spence  et  al.,  1995).  Mixed  and  forked  chains,  as  well  as  chains  formed  on  internal  lysine  residues  other  than  K11,  K48  and  K63  of  ubiquitin  are  still  under  intense investigation (Figure 3). 

Figure 3. Modes of ubiquitination  

Ubiquitin  is  primarily  attached  to  the  ‐amino  group  of  one  or  more  lysine  residues  of  a  substrate  (mono‐  and  multiubiquitination,  respectively)  or,  in  rare  cases,  to  the  N  terminus  of  a  substrate  (not  shown).  It  contains  seven  internal lysine residues all of which can serve as an acceptor for another ubiquitin moiety, thereby forming ubiquitin  chains (polyubiquitination). K11‐, K48‐, K63‐linked and linear chains, which are linked via C‐ and N terminus of two  ubiquitin moieties, function in proteasomal degradation, DNA‐repair or intracellular signaling, whereas the function 

1.1.3 Ubiquitin recycling and the proteasome

Processing  of  ubiquitin  precursor  proteins  as  well  as  recycling  of  ubiquitin  is  carried  out  by  deubiquitinating  enzymes  (DUBs)  which  mainly  exhibit  cysteine  protease  activity.  The  two  major classes of DUBs are UCHs (Ubiquitin COOH‐terminal Hydrolases) that preferentially cleave  ubiquitin  from  substrates  and  USPs  (Ubiquitin‐Specific Proteases)  that  additionally  hydrolyze  isopeptide bonds between two ubiquitin moieties. In addition, OUTs (otubain proteases), JAMM  metalloproteases  and  MJDs  were  found  to  function  as  DUBs  (summarized  in  (Sorokin  et  al.,  2009)).  

Some DUBs are associated with or even part of the 26S proteasome which degrades 80‐90 % of  intracellular proteins (Rock et al., 1994). The 26S proteasome consists of the 20S core particle  and two 19S regulatory particles. The core proteasome is composed of 14 α‐ and 14 β‐subunits  forming four heptameric rings which build a channel in whose inner part the target protein is  hydrolyzed. Three of the β‐subunits possess proteolytic activities ensuring efficient cleavage of  the  target:  subunit  β1  exhibits  caspase‐like  activity,  β2  has  trypsin‐like  and  β5  chymotrypsin‐

like  activity.  The  regulatory  particles  contain  subunits  that  fulfill  three  important  functions: 

interaction  with  the  ubiquitinated  substrate,  cleaving  ubiquitin  from  the  substrate  (by  isopeptidases) and unfolding the target protein (by ATPases) (reviewed in (Murata et al., 2009; 

Sorokin et al., 2009)).