Substrates and functions of NEDD8

     A       B 

 Figure 4. Crystal structure of NEDD8 (A) and overlay with ubiquitin and SUMO­1 (B) 

(A) The globular NEDD8 structure reveals a β‐grasp fold with four antiparallel β‐sheets and an α‐helix on top of them,  being  characteristic  for  ubiquitin  and  all  UBLs  (protein  data  base  1NDD;  modeled  using  Pymol).  The  C‐terminal  double glycine motif is marked in green. 

(B) Overlay of ubiquitin (blue), SUMO‐1 (green) and NEDD8 (red). Ubiquitin and the UBLs SUMO‐1 and NEDD8 exhibit  a highly similar structure characterized by the β‐grasp fold (Welchman et al., 2005). 

Investigation  of  NEDD8  expression  in  different  tissues  using  northern  blot  and  immuno‐

cytochemical analysis revealed NEDD8 mRNA is enriched in brain and skeletal muscle, and that  NEDD8 protein is predominantly found in the nucleus whereas ubiquitin is equally distributed  in the cell (Kamitani et al., 1997). 

In  mice,  knockout  of  the  catalytic  subunit  of  the  NEDD8  E1  enzyme,  UBA3,  was  shown  to  be  lethal  in  utero  at  the  periimplantation  state.  The  reason  for  this  phenomenon  lies  in  the  involvement of the NEDD8 pathway in cell cycle progression and morphogenesis, underlining its  indispensability for early development (Tateishi et al., 2001). In S. cerevisiae, however, depletion  of the NEDD8 homologue Rub1, as well as the respective E1 or the E2 enzymes does not affect  normal cell growth (Liakopoulos et al., 1998). 

1.3.1 Substrates and functions of NEDD8 

1.3.1.1 Cullins 

In 1998, Cullin4a was described as the first substrate of the NEDD8‐conjugation system (Osaka  et al., 1998). In the meantime, it turned out that modification of all canonical cullins with NEDD8  is crucial to execute their function (Hori et al., 1999; Ohh et al., 2002). Cullins are components of  multi‐protein  complexes,  the  cullin‐RING  ligases,  which  play  important  roles  in  cell  growth,  development,  signal  transduction,  transcriptional  control,  genomic  integrity  and  tumor  suppression  (see  also  1.1.1).  In  mammals,  there  are  six  canonical  cullins  (Cullin1,  Cullin2,  Cullin3, Cullin4a, Cullin4b, Cullin5) and three atypical cullins (APC2, Cullin7 and PARC) known 

N  N 

C  C 

which  together  build  more  than  500  distinct  multi‐subunit  complexes  (Petroski  and  Deshaies,  2005a; Skaar et al., 2007; Zachariae et al., 1998).   

Cullin‐RING  ligases  usually  consist  of  cullins  serving  as  scaffold  proteins,  substrate  adaptors,  which recognize and bind the respective substrate, and a RING domain protein with the catalytic  activity  to  ubiquitinate  the  substrate.  NEDDylation  of  the  cullin  subunit  at  a  conserved  lysine  residue leads to a conformational change which in turn recruits the ubiquitin‐loaded E2 enzyme  (Duda  et  al.,  2008;  Kawakami  et  al.,  2001).  In  addition,  NEDDylation  seems  to  promote  dimerization of cullin‐RING ligases through their substrate recognition subunit (Wimuttisuk and  Singer, 2007). Recently, it was suggested that rotation of the RING domain of the E3 also plays a  crucial  role  in  the  activation  of  the  cullin‐RING  complex  (Calabrese  et  al.,  2011).  Both  the  NEDD8‐  and  the  ubiquitin  E3  ligase  activity  of  the  complex  are  carried  out  by  either  RBX1  or  RBX2  (Petroski  and  Deshaies,  2005a).  Moreover,  Dcn1  in  yeast  and  DCNL  proteins  in  humans  serve as a scaffold‐type E3 ligases which interact with the respective cullin and the NEDD8 E2 at  the same time thereby enhancing NEDDylation of cullins and thus, the ubiquitination activity of  cullin‐RING complexes (Kurz et al., 2008; Monda et al., 2013; Yang et al., 2007).  

As already mentioned, cullin complexes share a general composition. Dependent on the cullin,  however,  several  different  substrate  adaptors  can  be  used.  So  called  SCF  complexes  consist  of  Cullin1, RBX1, the adaptor protein Skp1 and an F‐box protein which specifically interacts with  the substrate to be degraded (Lyapina et al., 1998). One of the substrates for the SCF complex  with  Skp2  as  F‐box  protein  is  p21,  an  important  regulator  of  cell  proliferation  and  differentiation.  Phosphorylation  of  p21  by  Cdk2‐Cyclin  E  enhances  its  recognition  and  ubiquitination by SCF^Skp2, leading to its rapid degradation (Bornstein et al., 2003). Additionally,  not only cell cycle inhibitors but also cell cycle activators like Cyclin E are substrates for SCF^Skp2  (Nakayama et al., 2000). In contrast to Cullin1, Cullin2 and Cullin5 assemble with elongin B/C as  adaptor and a SOCS‐box containing protein as substrate receptor. A well‐studied substrate of the  Cullin2‐RING  ligase  is  HIFα,  an  important  player  in  oxygen  metabolism.  A  complex  formed  by  HIFα and HIFβ under hypoxic conditions controls the expression of several genes like VEGF or  erythropoietin  (Maxwell,  2003).  Oxygen‐dependent  hydroxylation  of  HIFα  leads  to  its  recognition by the tumor suppressor protein pVHL, a substrate receptor of the Cullin2‐complex,  and  its  subsequent  ubiquitination  and  degradation  (Ivan  et  al.,  2001;  Jaakkola  et  al.,  2001; 

Petroski and Deshaies, 2005a; Yu et al., 2001).  

Deactivation  of  cullin‐RING  complexes  is  achieved  through  removal  of  NEDD8  by  the  CSN5  subunit of the COP9 signalosome which belongs to the family of JAMM metalloproteases (Cope et  al.,  2002;  Lyapina  et  al.,  2001).  Another  mechanism  to  silence  cullin‐RING  complexes  is  the  binding  of  Cand1  (Cullin‐Associated  and  NEDDylation‐Dissociated  1)  which  inhibits  NEDDylation and the assembly of the whole complex by specifically binding to the region of the 

that Cand1 also serves as an important exchange factor for cullin‐RING ligase adaptors (Pierce et  al., 2013). 

1.3.1.2 NEDD8 and transcriptional regulation 

In the last decade, several new substrates of NEDD8 were described, giving insights into the role  of NEDD8 in various cellular functions. Interestingly, a majority of these substrates is involved in  transcriptional regulation.   

The tumor suppressor protein p53, which plays a major role in the regulation of cell cycle arrest  and apoptosis, is not only a substrate for ubiquitin but also for ubiquitin‐like proteins such as  SUMO or NEDD8 (Kruse and Gu, 2009; Rodriguez et al., 1999; Scheffner et al., 1993; Xirodimas et  al., 2004). NEDDylation of p53 by the RING ligase Hdm2 was shown to inhibit its transcriptional  activity. In the case of p53, Hdm2 displays a dual specificity since it had also been described as  an  E3  ligase  for  the  ubiquitination  of  p53  (Honda  et  al.,  1997;  Xirodimas  et  al.,  2004). 

Modification of p53 with NEDD8 is also promoted by FBXO11 and specifically inhibited by the  histone  acetyltransferase  Tip60  (Abida  et  al.,  2007;  Dohmesen  et  al.,  2008).  Interestingly,  C‐

terminal fusions of p53 with ubiquitin and NEDD8 to mimic its modification with these proteins  showed that p53‐ubiquitin is rather found in the cytoplasm, whereas fusions of p53 with NEDD8  localize in the nucleus (Carter and Vousden, 2008). 

Another  member  of  the  p53  family,  TAp73,  also  serves  as  a  substrate  for  Hdm2‐dependent  NEDDylation. Modification of TAp73 with NEDD8 inhibits its transcriptional activity which can  in part be explained by its localization to the cytoplasm (Watson et al., 2006). 

In  2008,  some  ribosomal  proteins  were  found  to  be  modified  with  NEDD8  causing  enhanced  stability  (Xirodimas  et  al.,  2008).  Further  investigation  of  the  ribosomal  protein  L11  revealed  that  its  NEDDylation  leads  to  a  localization  to  the  nucleolus  (Sundqvist  et  al.,  2009).  Upon  nucleolar stress, L11 is deNEDDylated and recruited to promoters of p53 regulated genes where  it  interacts  with  several  co‐activators.  In  addition,  binding  of  L11  to  Hdm2  at  these  promoter  sites  inhibits  interaction  of  p53  with  Hdm2,  thereby  promoting  transactivation  of  p53  target  genes.  Interestingly,  ribosome  biogenesis  is  not  affected  under  deNEDDylation  conditions  in  spite of reduced L11 levels (Mahata et al., 2011). 

NEDDylation also seems to play an important role in the regulation of NFκB activity. On the one  hand,  suppression  of  the  transcriptional  activity  of  NFκB  by  BCA3  is  dependent  on  its  modification with NEDD8 (Gao et al., 2006). On the other hand, TRIM40‐catalyzed NEDDylation  of IKKγ, an inhibitor of NFκB signaling, enhances the repression of NFκB (Noguchi et al., 2011). 

Another  protein  which  is  regulated  by  NEDDylation  is  AICD,  the  intracellular  domain  of  the  amyloid precursor protein (APP). APP is found in plaques that accumulate in brains of Alzheimer  patients. Cleaving of APP by secretases leads to the formation of  AICD amongst others, whose  role in Alzheimer development and progression is only poorly understood. Modification of AICD 

with  NEDD8  prevents  the  interaction  with  its  co‐activator  Fe65  and  the  histone  acetyltransferase  Tip60,  resulting  in  an  inhibition  of  the  transactivator  function  for  genes  involved in e.g. cell growth and motility (Lee et al., 2008; Muller et al., 2008).  

1.3.1.3 Further substrates and functions of NEDD8 

Modification with NEDD8 does not only play roles in transcriptional regulation but also in the  regulation  of  protein  stability.  The  ribosomal  protein  L11  and  the  E3  ligase  Hdm2  as  well  as  PINK1, a protein involved in Parkinson´s disease, show an enhanced stability upon modification  with NEDD8 (Choo et al., 2012; Xirodimas et al., 2004; Xirodimas et al., 2008).  

In addition, NEDDylation regulates the stability of distinct receptors. Ubiquitination of EGFR is  mediated  by  the  RING‐ligase  c‐Cbl,  leading  to  its  internalization  and  lysosomal  degradation.        

C‐Cbl  is  also  capable  of  NEDDylating  EGFR  and  therefore  displays  a  dual  specificity  as  Hdm2  does  for  modification  of  p53  (Oved  et  al.,  2006;  Xirodimas  et  al.,  2004).  Modification  of  EGFR  with NEDD8 leads to an increased turnover rate caused by intensified ubiquitination (Oved et al.,  2006). In the case of steroid hormone receptors, NEDD8 was even found to be required for their  ubiquitination  and  degradation.  Therefore,  inactivation  of  the  NEDD8  pathway  might  be  involved in the development of steroid hormone dependent tumors (Fan et al., 2003; Fan et al.,  2002). 

Parkin, a RING‐type E3 ligase which is frequently mutated in patients suffering from Parkinson´s  disease,  reveals  an  enhanced  activity  upon  NEDDylation.  Substrates  of  parkin  take  part  in  diverse  cellular  functions  like  transcription,  neurotransmission,  synaptic  function  or  cell  cycle  control (Choo et al., 2012; Walden and Martinez‐Torres, 2012). 

As  a  component  of  the  Cullin2/elongin  B/C  complex,  pVHL  is  involved  in  the  regulation  of  oxygen‐dependent ubiquitination of HIFα (see 1.3.1.1). Interestingly, pVHL is also required for  fibronectin matrix assembly, independent of Cullin2 (Stickle et al., 2004).  Toggling the binding  of pVHL to the cullin complex is achieved by its modification with NEDD8: NEDDylation leads to  its  interaction  with  fibronectin  whereas  its  association  with  Cullin2  is  inhibited  (Russell  and  Ohh, 2008). 

IAPs  (Inhibitor  of  Apoptosis)  are  often  found  to  be  overexpressed  in  cancer,  thereby  contributing to cell proliferation and survival. IAPs are RING ubiquitin E3 ligases that negatively  regulate  caspase  activity  and  additionally  have  an  influence  on  cellular  survival  functions.  In  Drosophila and humans, effector caspases were identified to act as substrates for NEDDylation  by IAPs leading to their inactivation (Broemer et al., 2010). However, it was also supposed that  IAPs themselves, rather than caspases, might be substrates for NEDD8 (Nagano et al., 2012).  

Very recently, both reduced levels of Ubc12 and inhibition of APPBP1/UBA3 were discovered to  impair T‐cell proliferation and cytokine production. Thereupon, NEDDylation of Shc, an adapter 

protein  between  the  antigen  receptor  of  T‐cells  and  the  Erk‐pathway,  was  identified  as  an  important event in T‐cell receptor signaling (Jin et al., 2013). 

In proteomic analyses, many further potential substrates for NEDD8 were identified which are  mainly  involved  in  mRNA  splicing,  DNA  replication  and  repair,  chromatin  remodeling  and  proteasomal degradation (Jones et al., 2008; Xirodimas et al., 2008). 

Finally, one well‐studied interaction partner of NEDD8 which targets NEDD8 and its conjugates  for  proteasomal  degradation  is  NUB1  (NEDD8 Ultimate Buster1)  (Kamitani  et  al.,  2001).  By  interacting with the S5a subunit of the proteasome, NUB1 not only delivers NEDD8 but also the  UBL  FAT10  for  degradation  (Hipp  et  al.,  2004;  Tanji  et  al.,  2005).  Interaction  of  NEDD8  with  NUB1  additionally  results  in  inhibition  of  NEDDylation  and  enhances  ubiquitination  of  p53,  leading to its cytoplasmic localization (Liu and Xirodimas, 2010).