U NTERSUCHUNGSZEITRAUM UND - MAßNAHMEN

Der Untersuchungszeitraum der Teilstudie I erstreckte sich von Mitte Juli bis Mitte September 2011. Für die Einzeltiere erstreckte sich die Dauer der Untersuchung über mindestens 36 bis maximal 86 Tage.

Bei allen 18 Tieren wurden täglich einmal die Adspektion des äußeren Genitals, die Entnahme eines Vaginalabstriches zur Anfertigung eines Ausstrichpräparates für die zytologische Untersuchung und die Überprüfung des Verhaltens gegenüber einem männlichen Tier durchgeführt.

In 3- bis 4-tägigen Abständen (2x pro Woche) wurden Blutproben (ca. 1,5 – 2 ml) für hormonanalytische Zwecke aus der V. saphena entnommen. Im Zusammenhang mit ovulationsinduzierenden Maßnahmen wurde die Blutentnahmefrequenz auf täglich oder 2-tägig erhöht. Die Gewinnung von Blutproben wurde bei den graviden Tieren in den letzten Tagen ante partum eingestellt, um das Einsetzen und den Verlauf der Geburt nicht zu stören.

Der Graviditätsnachweis erfolgte für jedes Tier einmalig 12 Tage post coitum durch sonographische Untersuchung mit dem Ultraschallgerät Adara Sonoline der Firma Siemens, unter der Verwendung eines 7,5 MHz Konvex-Schallkopfes. Für die Unter-suchung wurden die im Nacken fixierten Tiere von einer Hilfsperson in Rückenlage

gebracht. Nach der Rasur einer ca. 8 x 8 cm großen Fläche am mittleren Abdomen und der Verwendung von Ultraschallgel erfolgte die sonographische Untersuchung.

Handling der Tiere

Alle Tiere wurden an jedem Vormittag zweimal (1. zur Erfassung gynäkologischer Befunde, 2. zur Prüfung des Paarungsverhaltens) aus ihren Stallungen durch Unter-fassen im Bereich der Hinterläufe und gleichzeitiges Greifen der Nackenfalte heraus-gehoben. Durch leichtes Anlehnen der Tiere an den Oberkörper der haltenden Hilfs-person wurde der Rücken der Kaninchen unterstützt.

Adspektion der äußeren Genitale

Zur Adspektion der Vulva wurden die Oberschenkel der Kaninchen leicht gespreizt.

Es wurden Ödematisierungsgrad (gering-, mittel-, hochgradig), Öffnungsgrad (gering-, mittel-, hochgradig) und die Farbe (blass, rosa, rot) beurteilt. Weiterhin wur-den die Länge und Breite der Vulva mithilfe eines Lineals gemessen.

Entnahme einer Vaginalsekretprobe, Anfertigung und Auswertung der vaginal-zytologischen Ausstrichpräparate

Zur Entnahme einer Vaginalsekretprobe wurden die Labien der Vulva leicht ge-spreizt. Ein steriler Wattestieltupfer (Transportsystem Bacteriette®mini, Fa. EM-TE Vertrieb Hamburg) wurde mit steriler NaCL angefeuchtet und nur in der Länge des Wattekopfes (1 cm) in die Vagina eingeführt. Durch diese Vorgehensweise sollte zum einen, soweit möglich, die Auslösung der Ovulation vermieden und zum an-deren sichergestellt werden, dass Zellmaterial aus dem mit Vaginalmukosa ausge-kleideten kaudalen Teil des kaudozervikalen Genitaltraktes gewonnen wurde.

Das Zellmaterial wurde unmittelbar nach der Gewinnung in 3 – 4 Bahnen auf einem Objektträger (76 x 26 mm, Menzel GmbH, Braunschweig) ausgerollt. Mittels Fixa-tionsspray (Cyto-Spray medesign I.C.GmbH, Dietramszell-Linden) wurde der Aus-strich fixiert und nach Lufttrocknung mit Haema-Schnellfärbung Diff Quick® gemäß den Herstellerangaben angefärbt. Nach erneuter Lufttrocknung wurde der Objekträ-ger mit einem 24 x 60 mm großen Deckglas unter Verwendung von

ASSISTANT-Histokitt (Glaswarenfabricht Karl Hecht GmBH und Co KG, Sondheim/Rhön) einge-deckelt.

Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte mit einem Lichtmikroskop Eduval 4 Karl Zeiss Jena (Okular P10x Karl Zeiss Jena, Objektive x4/0,1, x10/0,25, x20/0,40 und x40/0,65).

Pro Ausstrich wurden jeweils 100 Zellen gezählt und nach tiefen Zellen (TZ) [Basal-(BZ), Parabasalzellen (PBZ), tiefe Intermediärzellen (tIMZ)] und hohen Zellen (HZ) [hohe Intermediärzellen (hIMZ), Superfizialzellen (SFZ), Schollen (SCH)] differenziert (Abb. 3 – 7).

Abb. 3: Tiefe (grüner Pfeil) und hohe (blauer Pfeil) Intermediärzellen sowie Superfizialzellen (roter Pfeil) (Objektiv x20/0,4; Okular P10x).

Abb. 4: Parabasalzellen (schwarzer Pfeil), tiefe (grüne) und vereinzelt hohe (blaue) Intermediärzellen (Objektiv x20/0,4; Okular P10x).

Abb. 5: Basalzellen (rot), tiefe (grün) und hohe (blau) Intermediärzellen (Objektiv x20/0,4; Okular P10x).

Abb. 6: Hohe Intermediärzelle (grü-ner Pfeil) mit Anzeichen beginnender Kernpyknose (Übergang zur Superfi-zialzelle), Superfizialzelle mit begin-nender Karyolyse (schwarzer Pfeil) (Objektiv x40/0,65; Okular P10x).

Abb. 7: Kernlose Scholle

(Objektiv x40/0,65, Okular P10x).

Blutentnahme und -aufbereitung

Für die Blutentnahme wurde der Kopf der Tiere zwischen Ellbogen und Körper der Hilfsperson fixiert, wobei das Becken der Kaninchen auf dem Unterarm und Hand-gelenk der anderen Hand positioniert wurde. Die V. saphena wurde durch Umfassen des Oberschenkels gestaut. Das Fell wurde im Bereich der Vene gescheitelt und die Haut mit Alkohol desinfiziert. Die Blutprobenentnahmen (1,5 – 2 ml) erfolgten mit sterilen, einmal verwendbaren Kanülen (Sterican®, 0,9 mm x 40 mm, G 20 x ½, Braun, Melsungen) und Vacutainer®-EDTA-Röhrchen.

Die Blutproben wurden innerhalb von 3 Stunden nach der Gewinnung zentrifugiert (10 min. bei 3030 x g). Anschließend wurde das Plasma in beschriftete, 1,5 ml fassende Eppendorfgefäße (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) überführt. Alle im Studienver-lauf gesammelten Plasmaproben wurden bis zur Hormonanalyse bei -20° C gelagert.

Prüfung des Paarungsverhaltens

Um möglichst aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, konnten sich die Tiere vor der Prüfung des Paarungsverhaltens ca. 1 bis 2 Stunden von dem nicht vermeidbaren Stress der Befunderhebung am äußeren Genitaltrakt und der Blutprobenentnahme erholen. Zur Prüfung des Paarungsverhalten wurde jedes Kaninchen einzeln in eine große, durch ein Gitter unterteilte Auslaufbox gesetzt. Auf der anderen Seite des Gitters befand sich der in der Rasse entsprechende Bock. Über einen Zeitraum von 5 Minuten wurden die Reaktionen der weiblichen Tiere auf die von dem männlichen Partner ausgehenden visuellen, olfaktorischen und akustischen Reize beobachtet.

Hormonbehandlung zur Ovulationsinduktion

Die Kaninchen der Gruppe 1 (Anovulatorischer Zyklus) blieben unbehandelt. Zur Auslösung der Ovulation wurde den Kaninchen der Gruppe 2 (Pseudogravidität) einmalig das GnRH-Analog Buserelin (Receptal®, 0,2 ml entspr. 0,8 μg Buserelin / Tier, Intervet Deutschland GmBH) intramuskulär in den Oberschenkel (M. semitendi-nosus) injiziert. Der Zeitpunkt der GnRH-Gabe wurde anhand der täglich erhobenen adspektorischen Befunde der Vulva und der mikroskopischen Auswertung der

vaginalzytologischen Ausstrichpräparate festgelegt (ausschlaggebend war das Vorherrschen hoher Zellen in der Vaginalzytologie). Die Tiere der Gruppe 3 (Gravidi-tät) wurden nach der Feststellung der Paarungsbereitschaft einmalig durch den Bock mit identischer Rassezugehörigkeit gedeckt. Zur Unterstützung der Ovulationsin-duktion wurde ihnen unmittelbar nach der Bedeckung Receptal® in gleicher Dosie-rung intramuskulär verabreicht.

Beobachtungen besonderer Verhaltensweisen im Untersuchungszeitraum Bei der zweimal täglich durchgeführten Adspektion der Stallungen wurde bei man-chen Tieren sowohl das aktive Strohsammeln wie auch Nestbau und Fellrupfen be-obachtet. Einige Tiere neigten in diesem Zeitraum zu einer erhöhten Aggressivität, die sich durch „fauchende“ Laute und Angreifen des Untersuchers äußerte. Auch Tage verminderter Futteraufnahme wurden im Untersuchungszeitraum beobachtet.

Überwachung des Geburtszeitraumes und Ermittlung der Wurfgröße

Eine gesonderte Adspektion der graviden Tiere und ihrer Stallungen wurde ab Tag 30 post coitum viermal täglich durchgeführt. Überprüft wurde sowohl der augen-scheinliche Allgemeinzustand der Tiere als auch eine bereits stattgefundene Geburt.

Die Wurfgröße wurde, nach Separieren des Muttertieres, durch behandschuhtes Zählen der im Nest befindlichen Welpen ermittelt.

Hormonanalysen

Die Analysen der Gesamtöstrogen- und Progesteronkonzentrationen im Blutplasma dienten der Bestimmung des Ovarstatus. Sie erfolgten im Endokrinologischen Labor (Klinik für Rinder) der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

Zur Messung der Gesamtöstrogenkonzentration wurden die Proben nach der Spal-tung von glucoronidiertem und sulphatiertem Östrogen mittels 0,2%

β-Glucoronidase/Acrylsulfatase (Merck, Germany) für 2 Stunden bei 37 °C in Natri-umacetatpuffer (Sigma aldrich, ph 4,8) verbracht. Danach wurden die Steroid-hormone unter Zugabe von 3 ml Ether (30% Butylmethylether, 70% Petrolether) aus dem Plasma extrahiert. Durch einen direkten Enzym-Immunoassay (EIA) (PRAKASH

et al. 1987), unter der Verwendung einer mit Antikörpern gegen Östrogen (100& E1, 100% E2) beschichteten Mikrotiterplatte und der Zugabe von „Östrogen gekoppelt mit Peroxidase“ als Enzymkonjugat, wurde die Gesamtöstrogenkonzentration be-stimmt. Die minimal ermittelte Konzentration war 8 pg/ml, der Intraassay-Variationskoeffizient wurde mit 8,5%, der Interassay-Intraassay-Variationskoeffizient mit 17,4%

angegeben.

Progesteron wurde mittels eines kompetitiven Immunoassays (Immulite®, Siemens Diagnostic, CA, USA) bestimmt. Das Testsystem basiert auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion, wobei an polyklonalen Antikörpern gegen Progesteron eine kompetitive Situation zwischen dem nativem Antigen (Progesteron in der Probe) und enzymmarkiertem Progesteron entsteht. Je höher die Progesteronkonzentration in der Probe, desto weniger Substrat wird vom Enzym umgesetzt. Dabei entsteht ein instabiles Anion, welches bei Zerfall Licht emittiert. Dieses wird im Gerät detektiert und anhand einer hinterlegten Standardkurve berechnet. Der Intraassay-Variationskoeffizient liegt bei 5,3 – 16%, der Interassay-Intraassay-Variationskoeffizient bei 5,8 – 16% und der untere Messbereich bei < 0,09 ng/ml.