TWIK1 in den β-Zellen der Maus

5.2.1 Lokalisation von TWIK1 im Pankreas der Maus

In Immunfluoreszenz-Experimenten wurde eine starke Expression von TWIK1 in den Langerhans Inseln des Pankreas beobachtet, wohingegen das exokrine Drüsengewebe kein Signal zeigte (Abb. 17). Kofärbungen ergaben, dass TWIK1 fast ausschließlich in den Insulin-produzierenden β-Zellen lokalisiert war. Die Glucagon-produzierenden α-Zellen und die Somatostatin-produzierenden δ-Zellen des endokrinen Pankreas hingegen zeigten kaum eine Färbung (Abb. 18). Die Expression von TWIK1 in den PP-Zellen wurde nicht untersucht, da diese nur etwa 5% der gesamten Zellen einer Insel ausmachen (Cabrera et al., 2006). Eine Analyse der subzellulären Lokalisation in β-Zellen ergab, dass TWIK1 nur in granulären Strukturen im Zytosol anzutreffen war. Außerdem wurde eine partielle Kolokalisation von TWIK1 mit insulinhaltigen Granula beobachtet (Abb. 19). Die bisher in der Literatur beschriebene Lokalisation von TWIK1 in nicht-polarisierten Zellen beschränkt sich ebenfalls auf ein intrazelluläres Kompartiment, welches analog zu den polarisierten Zellen als endosomales Recycling Kompartiment identifiziert werden konnte.

Dieses liegt jedoch nicht am apikalen Pol der Zelle, sondern gruppiert sich in einem weiten Bereich um den Zellkern herum (pericentriolar recycling endosomes) (Decressac et al., 2004). Es ist vorstellbar, dass TWIK1 hier zwischengespeichert wird, bis ein bestimmter Stimulus den Einbau in die Zellmembran veranlasst. Allerdings konnte in Gewebeschnitten des Pankreas keine eindeutige Membranfärbung beobachtet werden.

Dabei wurden sowohl nüchterne Mäuse untersucht als auch Mäuse, deren Insulinsekretion kurz vor dem Fixieren durch eine intraperitoneale Glucoseinjektion stimuliert wurde (Daten nicht gezeigt). TWIK1 scheint also in den β-Zellen der Maus eine intrazelluläre Rolle zu spielen. Die partielle Kolokalisation mit insulinhaltigen Vesikeln legt die Vermutung nahe, dass TWIK1 eher an der Reifung oder Freisetzung der Granula beteiligt ist, statt in der Zellmembran als Kaliumkanal zu fungieren. Allerdings wurde TWIK1 auch ohne Kolokalisation mit Insulingranula beobachtet. Es ist denkbar, dass die zytosolischen Areale, in denen nur TWIK1 lokalisiert ist, auf die beschriebene Lokalisation im endosomalen Recycling Kompartiment zurückgeführt werden kann. Andererseits wurden auch insulinhaltigen Vesikel beobachtet, welche keine TWIK1 Färbung zeigten.

Hier kann gemutmaßt werden, dass TWIK1 nur mit Granula interagiert, welche sich in einem bestimmten Reifestadium befinden.

5.2.2 TWIK1^-/- Mäuse zeigen eine verstärkte Insulinsekretion

Um die physiologische Relevanz der TWIK1 Expression im Pankreas zu untersuchen, wurden in vivo Experimente an TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen durchgeführt. Dabei wurde

die Insulinsekretion bei den Versuchstieren durch intraperitoneale Injektion von Glucose (Intraperitonealer Glucosetoleranztest, IPGTT) (Abb. 20) oder durch Fructosediät (Abb.

21) stimuliert. Verglichen mit TWIK1^+/+ Mäusen führte dies bei TWIK1^-/- Mäusen zu einer verstärkten Insulinfreisetzung und in Folge dessen zu niedrigeren Glucosekonzentrationen im Plasma. Diese Befunde liefern starke Hinweise für eine mögliche Beteiligung von TWIK1 bei der Insulinsekretion. Allerdings wäre es ebenso denkbar, dass TWIK1^-/- Mäuse eine größere β-Zellmasse aufweisen, sei es durch eine vermehrte Anzahl von Inseln pro Pankreas oder durch eine größere Inselfläche.

Mikroskopische Vermessung der Langerhans Inseln bei TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen führten aber zu einem gegenteiligen Ergebnis. So zeigten TWIK1^-/- Mäuse eher eine reduzierte Inselfläche (Abb. 22A) bei einem vergleichbaren prozentualen Anteil an α- und δ-Zellen (Abb. 22B). Dies würde auf eine reduzierte β-Zellmasse bei TWIK1^-/- Mäusen hindeuten, vorausgesetzt die Anzahl an Inseln pro Pankreas wäre bei TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen in etwa gleich gewesen. Allerdings sind diese Ergebnisse mit großer Vorsicht zu interpretieren, da die Gesamtfläche einer Langerhansinsel durch ihre runde bis ovale Form stark von der getroffenen Schnittebene abhängig ist. Zudem wurde keine aufwendige Bestimmung der Gesamtanzahl an Langerhans Inseln pro Pankreas vorgenommen. Wir gehen aber nicht davon aus, dass morphologische Veränderungen als Grund für die verstärkte Insulinsekretion bei TWIK1^-/- Mäusen in Frage kommt. Vielmehr weisen die in vitro Daten darauf hin, dass TWIK1 in den β-Zellen der Maus eine direkte Rolle bei der Insulinsekretion spielt. Experimente wurden durchgeführt, bei denen isolierte Langerhans Inseln von TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen mit Glucose zur Insulinsekretion stimuliert wurden (Abb. 23). In Übereinstimmung mit den in vivo Experimenten zeigten auch hier Inselzellen von TWIK1^-/- Mäusen eine gesteigerte Insulinsekretion im Vergleich zu Inselzellen von TWIK1^+/+ Mäusen. Durch diese Methode konnte weitgehend ausgeschlossen werden, dass TWIK1 beispielsweise über Modulation weiterer physiologischer Stimulatoren/Inhibitoren der Insulinfreisetzung indirekt an der Sekretion beteiligt war.

Sowohl in den in vivo als auch in den in vitro Experimenten wurden keine Unterschiede bei der Insulinfreisetzung von TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen unter Kontrollbedingungen beobachtet. Dies liefert Hinweise darauf, dass TWIK1 auf die basale Insulinausschüttung keinen Einfluss hat, sondern erst bei einer stimulierten Sekretion seine Aufgabe erfüllt.

Betrachtet man den Verlauf der Insulinsekretion beim in vitro Versuch (Abb. 23), so erkennt man, dass TWIK1 sowohl an der 1. Phase als auch an der 2. Phase der Freisetzung beteiligt sein muss. Zum einen erreichten Inseln von TWIK1^-/- Mäusen deutlich höhere Spitzenwerte bei der initialen schnellen Sekretion, welche in Übereinstimmung mit der Literatur in unseren Experimenten etwa 5-10 min anhielt (Barg

et al., 2002a). Außerdem wurde bei anhaltender Stimulation auch eine vermehrte Freisetzung bei der nachfolgend langsamen Phase der Insulinsekretion beobachtet.

Zudem benötigten Inseln von TWIK1^-/- Mäusen längere Zeit um wieder auf die basale Insulinfreisetzung zurückzukehren. Dies deutet darauf hin, dass hier vielleicht Mechanismen gestört sind, welche eine adäquate Beendigung der Insulinsekretion bewirken. Ferner war auffällig, dass Langerhans Inseln von TWIK1^-/- Mäusen eine höhere statistische Streuung bei der Menge an sezerniertem Insulin aufwiesen, was eventuell mit einer beeinträchtigten Regulation der Insulinsekretion oder mit einer mehr oder minder ausgeprägten Kompensation der gestörten TWIK1 Funktion erklärt werden kann.

5.2.3 TWIK1 arbeitet in β-Zellen nicht als Kaliumkanal in der Plasmamembran

Die beobachteten Phänomene legen nahe, dass TWIK1, entsprechend seiner Funktion als Kaliumkanal, eine Rolle bei der Repolarisation der Zellmembran von β-Zellen spielt.

Es wurde zunächst vermutet, dass TWIK1 zusammen mit Kv2.1 einen repolarisierenden Kaliumstrom liefert, welcher für eine Beendigung der Glucose-induzierten, Ca²⁺ -abhängigen Aktionspotentiale sorgt. Somit hätte ein Verlust der TWIK1 Funktion zu einer gesteigerten zytosolischen Ca²⁺ Aktivität und folglich zu der beobachteten verstärkten Insulinfreisetzung bei TWIK1^-/- Mäusen führen müssen. Für diese Fragestellung wurden fluoreszenzoptische Ca²⁺-Messungen mit Fura-2 an isolierten Langerhans Inseln von TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen durchgeführt (Abb. 24). Überraschenderweise zeigten jedoch Inseln von TWIK1^-/- Mäusen eher eine verringerte Ca²⁺-Antwort auf eine Glucose-induzierte Depolarisation. Diese lag im Vergleich zu TWIK1^+/+ Mäusen während der Stimulation mit 20 mM Glucose signifikant niedriger und auch die maximale Ca²⁺-Aktivität (Peakhöhen bei 10 mM und 20mM Glucose) war verringert. Eine Erklärung für dieses Phänomen kann mit dem momentanen Kenntnisstand nicht geliefert werden. Allerdings kann daraus gefolgert werden, dass die vermehrte Insulinsekretion bei TWIK1^-/- Mäusen nicht über eine gesteigerte zytosolische Ca²⁺-Aktivität erfolgt. Zudem sprechen zwei weitere Fakten gegen eine Beteiligung von TWIK1 bei der Repolarisation der Ca²⁺ -abhängigen Aktionspotentiale. Zum einen konnte TWIK1 in der Zellmembran von β-Zellen immunhistochemisch nicht nachgewiesen werden, zum anderen regulieren normalerweise spannungsabhängige Kaliumkanäle wie Kv2.1 Repolarisationsvorgänge von Aktionspotentialen. Eine Beteiligung von 2-P-Domänen Kaliumkanälen an solchen Prozessen scheint unwahrscheinlich, da diese aufgrund ihrer biophysikalischen Eigenschaften als so genannte „background“ Kaliumkanäle eher für die Aufrechterhaltung und Einstellung des Ruhemembranpotentials verantwortlich sind.

Um eine Beteiligung von TWIK1 am Membranpotential von β-Zellen zu untersuchen, wurden Patch-Clamp Messungen an isolierten Inselzellen von TWIK1^+/+ und TWIK1

-/-Mäusen durchgeführt. Für diese Experimente wurde der so genannte Slow-Whole-Cell-Modus gewählt, da hierbei kein Austausch von ATP und Glucose zwischen Zelle und Pipette stattfinden kann. Da das Membranpotential von β-Zellen hautsächlich durch die Aktivität des ATP-sensitiven Kaliumkanals Kir6.2 dominiert wird, würde somit eine Dialyse dieser Stoffe zu verfälschten Potentialmessungen führen. Die Ergebnisse zeigten jedoch klar, dass TWIK1 nicht an der Generierung des Ruhemembranpotentials beteiligt ist (Abb.

26). Unter Kontrollbedingungen wiesen Inselzellen von TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen keine Unterschiede im Membranpotential auf. Ferner wurde auch der Schwellenwert für die Öffnung von spannungsabhängigen Ca²⁺-Kanälen durch den TWIK1 knockout nicht beeinflusst. Bei einer Depolarisation der Zelle mit 10 mM Glucose lag dieser etwa bei -55 mV, was in guter Übereinstimmung mit dem in der Literatur beschriebenen Wert von -50 mV ist (Ashcroft et al., 1989). Ferner wurden auch bei der Frequenz und der Höhe der Akionspotentiale kein Unterschiede beobachtet (Daten nicht gezeigt), was wiederum eine Rolle von TWIK1 bei der Repolarisation der Ca²⁺-abhängigen APs unwahrscheinlich macht.

Um den Beitrag von TWIK1 an der Kaliumleitfähigkeit von β-Zellen zu untersuchen wurden weitere Patch-Clamp Experimente im Whole-Cell-Modus an isolierten Inselzellen von TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen durchgeführt. Ein direkter Vergleich der Stromantworten auf definierte Klemmspannungen ergab jedoch, dass diese sich weder in der Form, noch in der Kinetik unterschieden. Die Stromkurven von Inselzellen aus TWIK1^+/+ und aus TWIK1^-/- Mäusen zeigten in identischer Weise einen Kaliumstrom mit leicht inaktivierender Kinetik bei positiven Klemmspannungen (Abb. 28). TWIK1 scheint also keinen Beitrag zum Kaliumstrom der β-Zellen zu leisten. Um eine mögliche Beteiligung während Phasen der Insulinsekretion zu untersuchen, wurden die Zellen mit Tolbutamid stimuliert. Diese Behandlung führte analog zur Behandlung mit Glucose (Abb.

25) zunächst zu einer Depolarisation der β-Zellen, verursacht durch die Hemmung von Kir6.2, gefolgt von Ca²⁺ abhängigen Aktionspotentialen (Abb. 27). Jedoch waren auch hier keine offensichtlichen Unterschiede bezüglich From und Kinetik des Kaliumstroms zu beobachten. Auch der durch Tolbutamid hemmbare Anteil des Kaliumstroms war zwischen Inselzellen von TWIK1^+/+ und TWIK1^-/- Mäusen nicht verschieden (Abb. 28).

Eine Analyse der I-V-Diagramme bestätigte diese Befunde (Abb. 29). Weder der initial gemessene Strom (I_initial), noch der nicht-inakivierende Anteil (I_final) waren unter Kontrollbedingungen zwischen den Versuchsgruppen verschieden. Interessanterweise wurde jedoch nach Behandlung mit Tolbutamid beobachtet, dass I_final bei Inselzellen von TWIK1^-/- Mäusen bei Klemmspannungen positiver als -20 mV höher lag. Dieser Unterschied wurde in der Tendenz ebenso bei allen anderen I-V-Diagrammen beobachtet.

Dies würde bedeuten, dass die Kaliumleitfähigkeit von β-Zellen trotz der Inaktivierung der

Kanalfunktion von TWIK1 eher zunimmt. Diese Beobachtung ist umso erstaunlicher, wenn man bedenkt, dass TWIK1^-/- Mäuse eine höhere Insulinausscheidung aufweisen. So würde man erwarten, dass ein Anstieg der Kaliumleitfähigkeit durch Hyperpolarisation der Zellmembran eine Sekretion von Insulin eher hemmt als fördert. Eine befriedigende Erklärung für diese Beobachtung kann im Rahmen der bisherigen Ergebnisse nicht geliefert werde. Allerdings kann mit Sicherheit gesagt werden, dass unter den gewählten experimentellen Bedingungen TWIK1 keinen Beitrag zum Membranpotential oder zur Kaliumleitfähigkeit in β-Zellen der Maus leistet. Wenn überhaupt, dann führt der TWIK1 knockout in der Tendenz eher zu einer Zunahme des Kaliumstroms.

5.2.4 Kanal-unabhängige Funktionen von TWIK1 in β-Zellen der Maus

Unserer Vorstellung nach übt TWIK1 in den β-Zellen der Maus keine Funktion als membranständiger Kaliumkanal aus. Dafür sprechen zwei experimentelle Befunde: 1) TWIK1 wurde in Immunfluoreszenz-Experimenten nicht in der Zellmembran beobachtet, sondern zeigte eine relativ homogene und granuläre Verteilung über das Zytosol. 2) TWIK1 trägt offensichtlich nicht zum Membranpotential und zur Kaliumleitfähigkeit der Insulin produzierenden Zellen bei. Trotzdem zeigen β-Zellen von TWIK1^-/- Mäusen sowohl in vivo als auch in vitro eine gesteigerte Insulinproduktion. Über mögliche Ursachen kann mit dem jetzigen Kenntnisstand nur spekuliert werden. Wir glauben, dass diese Beobachtungen aus der Interaktion von TWIK1 mit ARF6 resultieren. In Immunfluoreszenz-Experimenten wurde eine Expression von ARF6 in Gewebeschnitten des Pankreas beobachtet (Abb. 30). Diese war bislang nur für die Insulin-produzierenden Zelllinien MIN6 und HIT-T15 beschrieben, wo ARF6 mit Hilfe von Western-Blots identifiziert werden konnte (Lawrence et al., 2003; Grodnitzky et al., 2007). Dabei wurde ARF6 nicht nur in den β-Zellen beobachtet, sondern in nahezu allen Zellen der Langerhans Inseln und ferner in geringerem Maße auch im exokrinen Pankreas. ARF6 war in den β-Zellen ebenfalls überwiegend intrazellulär lokalisiert. Allerdings waren auch Zellen vorhanden, bei denen sich das G-Protein in einem schmalen Bereich unterhalb der Plasmamembran konzentrierte. So ist beschrieben worden, dass sich ARF6 zwischen Plasmamembran und den Recycling Endosomen hin und her bewegt (Prigent et al., 2003). Obwohl eine partielle Kolokalisation von TWIK1 mit ARF6 beobachtet werden konnte, war TWIK1 doch überwiegend homogen über das Zytosol verteilt (Abb. 30). Wie bereits in der Einleitung beschrieben wurde, ist ARF6 an der Insulinsekretion beteiligt.

Ferner wurde eine Interaktion von TWIK1 mit dem ARF6/EFA6 Komplex beschrieben, welcher in nicht-polarisierten Zellen vermutlich für die Internalisierung von TWIK1 verantwortlich ist (Decressac et al., 2004). Jedoch wurde auch gezeigt, dass eine Überexpression von TWIK1 in Zellmodellen zu einer Verlangsamung der Endozytoserate

von Transferrin führte. Interessanterweise war dieses Phänomen auch bei Überexpression einer TWIK1-Mutante zu beobachten, deren Kanalfunktion durch eine Punktmutation zerstört wurde (TWIK1C69S). Da der Cysteinrest in Position 69 wahrscheinlich für die Dimerisierung des Kanals verantwortlich ist, führt ein Austausch dieser Aminosäure zu einem funktionsunfähigen Kanalprotein. Allerdings bleibt dadurch die Bindungsstelle für EFA6/ARF6 unbeeiflusst, welche sich am intrazellulären C-Terminus befindet (Decressac et al., 2004). Die Überexpression einer TWIK1 Mutante, bei der dieser Teil des Carboxy-Terminus entfernt wurde, hatte keinen Effekt mehr auf die Endozytose. Es wurde unter anderem diskutiert, dass TWIK1 bei Recycling-Prozessen von Membranproteinen eine Rolle spielen könnte. Möglicherweise werden Translokationsprozesse von ARF6 zwischen Plasmamembran zu den Recycling-Endosomen durch Bindung an TWIK1 verlangsamt. Dies führt dann in Folge zu einer veränderten Oberflächenexpression anderer Membranproteine, wie beispielsweise dem Transferrinrezeptor. Dieses Modell könnte im Falle der β-Zellen wichtige Hinweise liefern.

So wäre es denkbar, dass das veränderte TWIK1 Protein von TWIK1^-/- Mäusen nicht mehr in der Lage ist, ARF6 zu binden. Somit stünde der Zelle mehr ARF6 zur Verfügung, welches für die Insulinsekretion eine wichtige Rolle spielt. Es ist somit denkbar, dass z.B.

eine gesteigerte Aktivierung der Phospholipase D (PLD) stattfindet, welche ihrerseits einen fördernden Einfluss auf die Sekretionsleistung der Zelle ausübt. Dieser Mechanismus könnte erklären, warum es bei TWIK1^-/- Mäusen zu einer verstärkten Insulinfreisetzung kommt, zumal die Aktivität der PLD auf beide Phasen der Insulinsekretion Einfluss nimmt (Hughes et al., 2004). Allerdings gibt es mehrere Argumente, welche gegen diese Hypothese sprechen: 1) In MIN6 Zellen hatte die Überexpression von ARF6 keinen Einfluss auf die Insulinfreisetzung. Nur die Expression der inaktiven ARF6T27N-Mutante führte zu einer verminderten Sekretionsrate, wobei aber nur die 1. Phase der Insulinausschüttung betroffen war (Lawrence et al., 2003). 2) Es gibt bislang keine Untersuchungen, inwieweit das TWIK1-knockout-Protein zu Interaktionen mit ARF6 fähig ist. Da das C-Terminale Ende des Proteins noch intakt ist, welches die Bindungsstelle für EFA6/ARF6 enthält, ist eine erhaltene Interaktion nicht ausgeschlossen. 3) Es konnte nicht überprüft werden, ob in β-Zellen von TWIK1^-/- Mäusen ARF6 eine andere Lokalisation aufweist als bei TWIK1^+/+ Mäusen, da die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellte Menge an anti-ARF6 Antikörper dafür nicht ausreichend war. So wäre es von großem Nutzen gewesen, die subzelluläre Lokalisation von ARF6 genauer zu untersuchen, sowohl bei nüchternen Mäusen als auch bei Mäusen, deren Insulinsekretion stimuliert wurde.

Im Zusammenhang mit ARF6 sind noch weitere Modelle vorstellbar. Es kann spekuliert werden, dass TWIK1 direkt an der Aktivierung der PLD über ARF6 beteiligt ist.

Interessanterweise wurde bei der PLD eine partielle Kolokalisation mit insulinhaltigen Granula in MIN6-Zellen beobachtet (Hughes et al., 2004). Allerdings konnten wir aus Mangel an einem anti-PLD Antikörper bislang nicht bestätigen, dass diese Vesikel mit jenen übereinstimmen, welche auch eine TWIK1 Färbung aufweisen. Es ist somit möglich, dass das TWIK1 knockout Protein zu einer verstärkten ARF6-vermittelten Aktivierung der PLD führt, ohne dass sich die intrazelluläre ARF6 Konzentration bzw. Lokalisation ändert.

Dieses Modell würde sehr gut zu der Beobachtung passen, dass beide Phasen der Insulinfreisetzung vom TWIK1 knockout beeinflusst wurden. Ferner wäre denkbar, dass das TWIK1 knockout Protein eine gesteigerte Affinität zu ARF6 aufweist und dessen intrazelluläre Konzentration dadurch erniedrigt wird. Dies könnte einen destabilisierenden Einfluss auf das Zytoskelett haben, wodurch die Exozytose insulinhaltiger Granula bei β-Zellen von TWIK1^-/- Mäusen erleichtert wird.

Bei Kofärbungen von TWIK1 mit Vamp8 (Endobrevin) wurde von uns in Gewebeschnitten des Pankreas eine Kolokalisation der beiden Proteine beobachtet (Abb. 30). Vamp8 ist ein Mitglied der v-SNARE Familie und ist in MDCK-Zellen auf das endosomale Recycling Kompartiment beschränkt. In den polaren Epithelzellen ist Vamp8 nur im apikalen Pol der Zelle lokalisiert und dient hier wahrscheinlich dem endosomalen Verkehr (Steegmaier et al., 2000). Die bereits erwähnte Lokalisation von TWIK1 im endosomalen Recycling Kompartiment wurde unter anderem aus einer Koexpression von TWIK1 mit Vamp8 abgeleitet (Decressac et al., 2004). In den Insulin produzierenden MIN6-Zellen wurde Vamp8 jedoch in den frühen Endosomen gefunden, wobei aber eine zusätzliche Lokalisation in Recycling Endosomen nicht ausgeschlossen wurde (Nagamatsu et al., 2001). Immunfluoreszenz-Experimente zeigten hier eine granuläre Verteilung von Vamp8 über das gesamte Zytosol, vergleichbar mit unseren TWIK1 Färbungen in nativen β-Zellen. Interessanterweise führte eine Überexpression von Vamp8 in MIN6- und INS1-Zellen, aber auch in isolierten β-Zellen von Ratten, zu einer verminderten Glucose-induzierten Insulinausschüttung. Da Vamp8 sowohl mit Syntaxin 1A (Nagamatsu et al., 2001) als auch mit α-SNAP (Wong et al., 1998) interagiert, wird angenommen, dass dieses Protein eine wichtige Rolle beim „Docking“ oder der Fusion von endozytotischen Vesikeln mit den Endosomen spielt. Der genaue Mechanismus, über welchen Vamp8 die Insulinsekretion beeinträchtigt, ist unklar. Es wird aber vermutet, dass dieses SNARE Protein am Recyclingprozess von insulinhaltigen Granula beteiligt ist, d.h. bei der Rückführung von vesikulären Proteinen und Membranbestandteilen nach Verschmelzung der Granula mit der Plasmamembran. Nachdem diese Proteine durch Endozytose internalisiert werden, erfolgt ein Transport zum trans-Golgi Netzwerk (TGN) oder zu den frühen Endosomen (Patzak and Winkler, 1986; Hurtley, 1993; Partoens et al., 1998).

Allerdings findet in den frühen Endosomen vermutlich kein Recycling der vesikulären Proteine statt, sondern eine Vorbereitung für den Abbau in Lysosomen. Es wurde postuliert, dass die Überexpression von Vamp8 zu einer verstärkten Degradation der vesikulären Proteine über den endosomalen Weg führt, da eine Fusion der Granula mit den Endosomen begünstigt wird. Dadurch stehen diese Komponenten in geringerem Umfang für die Wiederverwertung im TGN zur Verfügung. Dies führt dann wahrscheinlich zu einer verminderten Produktion von insulinhaltigen Granula im TGN und in Folge zu einer geringeren Sekretionsleistung der β-Zelle. Interessanterweise wurde erst kürzlich entdeckt, dass Vamp8 ebenfalls auf insulinhaltigen Granula lokalisiert ist (Brunner et al., 2007). Eigene Untersuchungen haben ergeben, dass Endobrevin stark in β-Zellen der Maus exprimiert wird und eine gute Kolokalisation mit TWIK1 zeigt. Diese Befunde liefern wichtige Hinweise darauf, dass TWIK1 nicht nur im endosomalen Recycling Kompartiment lokalisiert ist, sondern vermutlich auch in frühen Endosomen oder auf insulinhaltigen Granula. Dies würde zumindest die breite intrazelluläre Verteilung erklären. Ferner ist auch vorstellbar, dass TWIK1 in einem dieser Kompartimente mit Vamp8 interagiert. In der Einleitung wurde bereits ausführlich auf bisher beschriebene Wechselwirkungen von Ionenkanälen mit SNARE-Proteinen hingewiesen. Möglicherweise ist die Funktion von Vamp8 an die Interaktion mit TWIK1 gebunden. Es wäre vorstellbar, dass das TWIK1-knockout-Protein die Aktivität von VAMP8 vermindert und folglich mehr insulinhaltige Granula über das TGN wiederverwertet werden. Ein vermehrtes Angebot an vesikulären Membranproteinen könnte somit zu einem beschleunigten Recycling von Granula führen und letztendlich die höhere Insulinsekretion bei β-Zellen von TWIK1^-/- Mäusen erklären.

Allerdings ist es mehr als fraglich, ob die Neusynthese von Granula einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Insulinsekretion darstellt. Solch ein

Allerdings ist es mehr als fraglich, ob die Neusynthese von Granula einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Insulinsekretion darstellt. Solch ein