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Beitrag von TWIK1 zur Kaliumleitfähigkeit von β-Zellen

4. Ergebnisse

4.2 TWIK1 im Pankreas der Maus

4.2.7 Patch-clamp Messungen an isolierten Inselzellen

4.2.7.3 Beitrag von TWIK1 zur Kaliumleitfähigkeit von β-Zellen

In einer weiteren Patch-Clamp Versuchsserie wurde der Ganzzellstrom isolierter β-Zellen von TWIK1+/+ und TWIK1-/- Mäusen miteinander verglichen. Die Messungen erfolgten im ene Spannungen (-95

uf der Spannung (Abb. 27A oben), so erkennt man, dass zwischen

m

nach Zugabe von Whole-Cell-Modus durch Klemmen der Zellmembran auf verschied

mV bis +25 mV in 20 mV Schritten für jeweils 2 s). Die daraus resultierenden Ströme wurden unter Kontrollbedingungen (5 mM Glucose) und unter Behandlung mit Tolbutamid (100 µM in Kontroll-Lösung) gemessen. Tolbutamid ist ein Arzneistoff aus der Gruppe der Sulfonylharnstoffe und wird als orales Antidiabetikum bei Diabetes Typ 2 eingesetzt.

Diese Substanz führt, analog zur Wirkung von ATP, durch Hemmung des KATP-Kanals Kir6.2 in β-Zellen des Pankreas zu einer Insulinausschüttung. In diesem Experiment konnte also geprüft werden, wie groß der Beitrag von TWIK1 zur Kaliumleitfähigkeit der Zelle war, sowohl unter Ruhebedingungen als auch während Phasen der Insulinfreisetzung.

Abb. 27A zeigt einen Ausschnitt aus dem Verlauf eines repräsentativen Experiments an Inselzellen einer TWIK1+/+ Maus. Dargestellt ist der Effekt von Tolbutamid. Betrachtet man zunächst den Verla

den Klemmschritten in regelmäßigen Abständen für etwa 16 s in den CC-zero Modus gewechselt wurde. In diesen Phasen konnte die Änderung des Membranpotentials der Zelle verfolgt werden. Ganz analog zur Behandlung mit 10 mM Glucose führte die Gabe von Tolbutamid zunächst zu einer Depolarisation der Zellmembran, gefolgt von Aktionspotentialen. Diese waren wegen des besseren elektrischen Zugangs zur Zelle regelmäßiger und ausgeprägter als bei den Experimenten in Slow-Whole-Cell-Modus.

Im unteren Graphen von Abb. 27A ist die Stromantwort der Zelle auf die jeweiligen Klemmschritte dargestellt. Man erkennt hier, dass die schrittweise Erhöhung der Klemmspannung zu einem zunehmenden positiven Strom führte. Der beobachtete Stro war also im Wesentlichen ein Kaliumstrom, da a) per Definition der Ausstrom von Kationen aus der Zelle (bzw. der Einstrom von Anionen) einen zellpositiven Strom erzeugt und b) eine Anhebung der Klemmspannung die Triebkraft für K+-Ionen erhöht, die Zelle zu verlassen. Nach Zugabe von Tolbutamid wurde dieser Strom kleiner, was auf eine verminderte Kaliumleitfähigkeit der Zelle aufgrund der Hemmung von Kir6.2 zurückzuführen war. Vor allem bei sehr negativen Klemmspannungen konnten die ausgelösten Aktionspotentiale auch in der Stromantwort beobachtet werden. Diese negativen Peaks resultierten aus dem schnellen Einstrom von Ca2+ in die Zelle, dessen Triebkraft mit zunehmender Positivierung der Zellmembran abnahm.

Zur besseren Darstellung wurden in Abb. 28A die Ströme der jeweiligen Klemmspannungen überlagert (Superpositionen). Der linke Graph zeigt hierbei den Strom einer Spannungstreppe während der Kontrollphase und der rechte

Tolbutamid. Schön zu erkennen ist nun die Hemmung des Kaliumstroms durch Tolbutamid und die Aktionspotentiale. Im Vergleich dazu wurden in Abb. 28B die Superpositionen der β-Zelle einer TWIK1-/- Maus dargestellt. Da die Größe des Stroms von der Membranfläche und damit der Zellgröße abhängig ist, wurden die erhaltenen Werte auf 1 normalisiert. Diese Modifikation erlaubt eine bessere Vergleichbarkeit verschiedener Zellen bezüglich Form und Kinetik des Stroms. Jedoch wurden keine offensichtlichen Unterschiede zwischen β-Zellen von TWIK1+/+ und TWIK1-/- Mäusen beobachtet. Beide zeigten sowohl unter Kontrollbedingungen, als auch unter Behandlung mit Tolbutamid, einen Strom mit leicht inaktivierendem Charakter bei Spannungen größer -35 mV. Die Höhe des Stroms bei den jeweiligen Klemmspannungen war sehr ähnlich und auch der durch Tolbutamid hemmbare Anteil zeigte bei Durchsicht der Einzelexperimente keine Unterschiede.

Die statistische Auswertung erfolgte durch Erstellen der I-V-Diagramme (Abb. 29). Zur besseren Vergleichbarkeit erfolgte hier eine Normalisierung der Ströme nach der zu Beginn des Experiments gemessenen Zellkapazität (in pF) als Maß für die Zelloberfläche.

keit für Kalium, vor allem unter Aufgrund der inaktivierenden Charakteristik wurde der Strom zu Beginn (Iinitial) und am Ende (Ifinal) eines Klemmschrittes getrennt ausgewertet. Auch hier zeigten sich kaum Unterschiede zwischen β-Zellen von TWIK1+/+ und TWIK1-/- Mäusen. Unter Kontrollbedingungen waren die I-V-Kurven sowohl von Iinitial als auch von Ifinal gleich. Bei Inselzellen von TWIK1-/- Mäusen war eher eine leichte Tendenz zu höheren Strömen bei positiven Klemmspannungen zu beobachten. Unter Behandlung mit Tolbutamid zeigte sich ein ähnliches Bild, jedoch war hier Ifinal bei den Klemmschritten -15 mV, 5 mV und 25 mV signifikant höher bei Inselzellen von TWIK1-/- Mäusen.

Die Auswertung dieser Experimente zeigte, dass TWIK1 keinen Beitrag zur Kaliumleitfähigkeit von β-Zellen leistete. Überraschenderweise führte der Defekt der Kanalpore eher zu einer in der Tendenz höheren Leitfähig

Behandlung der Zellen mit Tolbutamid.

Tolbutamid CC-zero VC

Abb. 27: Effekte von Tolbutamid auf den Kaliumstrom von β-Zellen

Ausschnitt aus einem repräsentativen Experiment an einer primärkultivierten β-Zelle einer TWIK1+/+

Maus. Gezeigt wird der Effekt von Tolbutamid (100 µM) auf das Membranpotential und den Kaliumstrom der Zelle. Die Messung erfolgte im Whole-Cell-Modus durch Klemmen der Zellmembran auf definierte Potentiale (-95 mV bis +25 mV in 20 mV Schritten, VC Modus). Im oberen Diagramm wird die Spannung in mV gezeigt. Die Spannungstreppen werden in regelmäßigen Abständen durch Messungen des Membranpotentials unterbrochen (CC-zero Modus). Die Behandlung der Zellen mit Tolbutamid führte, analog zu Glucose, zu einer initialen Depolarisation mit nachfolgenden APs (vergrößerter Ausschnitt). Im unteren Diagramm wird die Stromantwort der Zelle auf die jeweiligen Klemmspannungen gezeigt. Tolbutamid führte hier erwartungsgemäß zu einer Abnahme des Kaliumstroms durch Hemmung des Kaliumkanals Kir6.2.

A: B:

-/-Abb. 28: Superpositionen der Ströme von primärkultivierten β-Zellen

In den gezeigten Graphen wurden die Ströme auf die jeweiligen Klemmspannungen überlagert dargestellt. A zeigt ein repräsentatives Experiment an einer primärkultivierten β-Zelle einer TWIK1+/+ Maus und B das einer TWIK1-/- Maus. Die jeweils linke Superposition zeigt die Stromantwort der Zelle unter Kontrollbedingungen, die Rechte nach Zugabe von Tolbutamid. Um Form und Kinetik der Ströme besser vergleichen zu können, wurden diese auf 1 normalisiert.

Deutlich zu sehen ist die Hemmung des Stroms durch Tolbutamid und die daraus resultierenden APs. Die Superpositionen von TWIK1+/+ und TWIK1-/- Mäusen zeigten keine Unterschiede.

Kontrolle Tolbutamid

Iinitial

Ifinal

Abb. 29: I-V-Diagramme der Whole-Cell-Experimente

Dargestellt ist die statistische Auswertung der Whole-Cell-Experimente in Form von I-V-Diagrammen (jeweils n=12 für β-Zellen von TWIK1+/+ und TWIK1-/- Mäusen). Da der Strom einen leicht inaktivierenden Charakter zeigte, wurde zwischen Iinitial und Ifinal unterschieden (horizontale Einteilung). Die I-V-Diagramme wurden jeweils unter Kontrollbedingungen und nach Zugabe von Tolbutamid erstellt (vertikale Einteilung). Ein Defekt an der Kanalpore von TWIK1 führte jedoch in der Tendenz eher zu einer Zunahme des Kaliumstroms, vor allem unter Behandlung der Zellen mit Tolbutamid.