Histologische Methoden

3.2.2.1 Gewebefixierung durch retrograde arterielle Perfusion

Durch Fixierung des Gewebes sollen autokatalytische Vorgänge verhindert und die Zellstruktur in einem möglichst natürlichen Zustand erhalten werden. Darüber hinaus wird eine Härtung des Probenmaterials und damit eine bessere Schneidbarkeit bewirkt. Die Fixierung mit Paraformaldehyd führt zur Ausbildung von Querverbindungen zwischen den Eiweißmolekülen und damit zur Stabilisierung der Strukturen.

Die Versuchstiere wurden durch Inhalationsanästhesie mit Isofluran (2,5% Isofluran in einem Gasgemisch aus 50% Sauerstoff und 50% Stickstoff mit einem Fluss von 60 ml/min) narkotisiert. Nach Öffnen des Abdomens und Freilegen der Bauchaorta wurde die Aorta unterhalb der Abgänge der Arteriae renales abgeklemmt. Distal zur Klemme wurde der Perfusionskatheter eingeführt und mit einer Klemme fixiert. Als Abfluss für das Perfusat wurde die Vena cava inferior durch einen Schnitt geöffnet. Nach Entfernen der proximalen Aortenklemme wurden über den Katheter zunächst 10 ml Spüllösung (isotone NaCl-Lösung mit 10 I.E./ml Heparin) infundiert, wobei das Blut entfernt und eine eventuelle Blutgerinnung verhindert wurde. Danach erfolgte die retrograde Perfusion mit frisch angesetzter Fixierlösung I (3% Paraformaldehyd in gepufferter Salzlösung) mit

einem konstanten Fluss von 15 ml/min über eine Rollerpumpe. Die fixierten Organe wurden anschließend entfernt und entsprechend ihrer weiteren Bestimmung (Kryo- oder Paraffinpräparate) behandelt.

3.2.2.2 Einbettung in Paraffin

Die herausgenommenen perfundierten Organe wurden bis zur Paraffineinbettung in 70%

Methanol aufbewahrt. Zur Vorbereitung auf die Einbettung in Paraffin wurden die Gewebe dann in Gewebe-Einbettkassetten durch eine Methanolreihe zunehmender Konzentration (2 x 70%, 2 x 80%, 2 x 90%, 2 x 100%; jeweils mindestens 30 min) geführt und dabei schrittweise dehydriert. Anschließend wurde 3 x 30 min in 100% Isopropanol gespült, wobei das letzte Isopropanolbad 45°C hatte. Danach wurden die Präparate für 30 min in ein auf 55°C erwärmtes Isopropanol/Paraffin-Gemisch (1:1) überführt. Die Gewebe wurde dann für 48 h in 60°C warmem Paraffin inkubiert, wobei nach 24 h die Lösung gewechselt wurde, um Isopropanol Reste vollständig zu entfernen. Nachdem das Präparat völlig mit flüssigem Paraffin durchtränkt war, wurde es schließlich in Silikon-Kautschuk-Einbettformen in 60°C warmes, geschmolzenes Paraffin eingebettet. Die Abkühlung und Härtung erfolgte über Nacht bei 4°C.

3.2.2.3 Anfertigung von Paraffinschnitten

Zur Herstellung von Paraffinschnitten wurden die eingebetteten Präparate auf einen Holzblock aufgeklebt. Mit einem Rotationsmikrotom wurden 4 µm dicke Schnitte angefertigt, die in einem 40°C warmen Wasserbad gestreckt wurden. Nach dem Aufziehen auf Polysin-Objektträger wurden die Schnitte im Wärmeschrank bei 40°C mindestens 12 h getrocknet. Für die anschließenden Färbungen wurden die Schnitte durch 2 x 20 min Einbringen in 100% Xylol und nachfolgender absteigender Alkoholreihe (jeweils 20 min Ethanol 100%, 95%, 80%, 75%, PBS-Puffer) entparaffiniert und rehydriert.

Zur Epitop-Demaskierung wurden die Schnitte danach in Citratpuffer pH 6 für 15 min auf 94°C im Wasserbad erhitzt und anschließend mit PBS-Puffer 5 min lang gewaschen.

3.2.2.4 Vorbereitung der Kryopräparate

Die herausgenommenen perfundierten Organe wurden über Nacht bei 4°C in einer PBS-basierten Lösung inkubiert, welche 1% Paraformaldehyd und 17% Saccharose enthielt (Fixierlösung II). Danach wurden die Gewebe schonend in -35°C kaltem 2-Methylbutan eingefroren, da bei zu raschem Abkühlen Risse entstehen können, und anschließend bei -80°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Vor dem Schneiden wurden die Gewebestücke mittels Einbettung in OCT-Medium auf dem Objekthalter des Kryostaten fixiert.

3.2.2.5 Anfertigung von Kryoschnitten

Mit einem Kryostaten wurden 5 µm dicke Schnitte bei einer Kammertemperatur von -27°C angefertigt. Nach dem Aufziehen auf Polysin-Objektträger wurden die Schnitte für etwa 20 min bei RT getrocknet. Für die anschließenden Färbungen wurden die Objektträger für ca.

20 min in PBS getaucht, um das wasserlösliche OCT-Medium zu entfernen. Zur Epitop-Demaskierung wurden die Schnitte danach in 0,1% SDS-Lösung (in PBS) inkubiert und anschließend 2 x mit PBS-Puffer 5 min lang gewaschen.

3.2.2.6 Immunhistochemische Färbung

Unter Immunhistochemie versteht man den Nachweis antigener Komponenten in Zellen und Gewebeschnitten durch Antikörper (Ak), die mit Fluoreszenzfarbstoffen, Enzymen, Goldpartikeln oder Isotopen gekoppelt sind. Bei der indirekten Immunfluoreszenz-markierung bindet zunächst der primäre, unkonjugierte Antikörper (Primär-Ak) an das Antigen im Gewebeschnitt. Anschließend werden die Schnitte mit einem zweiten, fluoreszierenden Antikörper (Sekundär-Ak), der gegen den Fc-Teil des primären Antikörpers gerichtet ist, inkubiert. Dadurch wird der Antigen-Antikörper-Komplex detektierbar, wenn eine Anregung des Fluorophors mit Licht entsprechender Wellenlänge erfolgt.

Zur Abschwächung unspezifischer Bindungen wurden sowohl Kryo- als auch Paraffinschnitte für 20 min mit einer 5% BSA-Lösung (Block-Lösung) behandelt und anschließend 5 min mit PBS-Puffer gewaschen. Sowohl Primär- als auch Sekundär-Ak wurden mit einer PBS-Lösung verdünnt, welche 0,04% Triton X-100 enthielt (Ak-Verdünnungslösung). Dieses Detergens bewirkt eine Permeabilisierung der Zellmembranen im Gewebe und erleichtert die Diffusion der Ak zu intrazellulären Zielstrukturen. Die Objektträger wurden in der Primär-Ak haltigen Lösung über Nacht bei 4°C in einer feuchten, geschlossenen Kammer inkubiert. Nachdem die Schnitte 2 x 5 min in PBS gewaschen wurden, erfolgte die Inkubation der Gewebe mit dem Sekundär-Ak für 1 h bei RT unter Lichtabschluss. Nach abschließendem Waschen (2 x 5 min in PBS, kurzes Eintauchen in Aqua dest.) wurden die Objektträger mit Fluoreszenz-freiem Glycergel eingedeckelt.

3.2.2.7 Mikroskopie

Die Schnitte wurden mit einem konfokalen Mikroskop (LSM 510, Zeiss) untersucht. Als Objektiv diente ein Plan Apochromat 63x/1.4 Öl. Das Pinhole wurde auf 1 µM optische Schnittdicke eingestellt. Die Sekundär-Antikörper wurden mit monochromatischem Licht der Wellenlängen 488 nm (AlexaFluor® 488), 543 nm (AlexaFluor® 546) und 633 nm (AlexaFluor® 647) angeregt. Das emittierte Fluoreszenzlicht wurde entsprechend mit

Bandpass-Filtern von 505 nm bis 530 nm, von 560 nm bis 615 nm und mit einem Langpass-Filter >650 nm detektiert.