Transmissionselektronenmikroskopie

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ermöglicht den Blick in die Zelle, die Auflösungsgrenze liegt bei 0,3 nm. Es können somit Zellkomponenten wie Ribosomen, Einschlusskörper oder Membranen sichtbar gemacht werden. Hierbei treffen beschleunigte Elektronen in einem Vakuum auf das zu untersuchende Objekt, bei biologischen Proben sind dies Ultradünnschnitte von in Kunstharz eingebetteten Proben mit einer Schichtdicke von ca. 100 nm. Die Beschleunigungsspannung beträgt bei biologischen Proben 60 bis 100 kV, das sichtbare Bild ergibt sich durch die vorhandenen, bzw. nicht vorhandenen Wechselwirkungen der Elektronen mit den Atomen in der Probe (HOPPERT, 2003).

2.6.3.1 Einbettung prokaryotischer Zellen in Kunstharz

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Kunstharz LR White benutzt, welches ein späteres Immunogold-Markieren mit IgG-Antikörpern erlaubt (AGARWALA et al., 2009). Die verschiedenen Zellkulturen wurden den Versuchen entsprechend angezogen und durch

Zentrifugation mit 6000 upm (5000 × g) bei 4 °C für 5 min zu den gegebenen Zeitpunkten geerntet. Während der nachfolgenden Schritte wurden die Proben kontinuierlich auf Eis gelagert. Das erhaltene Pellet wurde einmal mit PBS gewaschen, wobei die Zellen vorsichtig mit einer Glaspipette resuspendiert wurden. Anschließend wurden die Zellen in einer Lösung aus 0,2 % Glutaraldehyd (w/v) und 0,3 % Formaldehyd (w/v) für mindestens 90 min, meist aber über Nacht, fixiert.

Nach der Fixierung wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen, in dem zuvor Glycin in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt wurde. Zentrifugiert wurde mit 5000 × g bei 4 °C für 2 min. 100 µl des gewaschenen Pellets wurden mit gleichem Volumen 58 °C warmen, 2 %igem Bacto-Agar in PBS mittels Pipette und einer abgeschnittenen Pipettenspitze vorsichtig vermischt, um die Zellen nicht durch auftretende Scherkräfte in Mitleidenschaft zu ziehen. Nach dem Mischen und ggf.

einem kurzen Abzentrifugieren wurde die Probe auf Eis gestellt und nach dem Erstarren aus dem Gefäß herausgelöst und mit Hilfe einer Rasierklinge in kubische Stücke von ca.

1 mm Kantenlänge zerteilt. Dem schlossen sich das Entwässern der in Bacto-Agar eingeschlossenen Proben (Tab. 2.6.1.) und das Einbetten in LR White mit anschließender Polymerisierung in Gelantinekapseln an.

Tabelle 2.6.1.: Das Austauschen von Wasser durch Kunstharz in den Proben Medium

Ethanol (w/v) in H2OMillipore

Inkubationszeit [min] Temperatur [°C]

15 % Ethanol 15 0 °C

30 % Ethanol 30 0 °C

50 % Ethanol 30 -20 °C

70 % Ethanol 30 -20 °C

95 % Ethanol 30 -20 °C

100 % Ethanol 30 -20 °C

100 % Ethanol 30 -20 °C

1/3 Ethanol ²/3 LR White 120 oder über Nacht RT oder bei 4 °C

LR White 120 oder über Nacht RT oder bei 4 °C

Einzelne Probenstücke wurden anschließend in mit frischem Kunstharz gefüllte Gelantinekapseln überführt. Die Proben wurden zentral in der Spitze der Kapseln

platziert und es sollte nach deren Verschluss möglichst wenig Luft in den Kapseln verbleiben.

2.6.3.2 Vorbereitung der Elektronenmikroskopie

Nach dem Aushärten des Kunstharzes in den Kapseln wurden diese zunächst angefräst, um die eingebettete Probe freizulegen. Anschließend sind mit einem Ultramikrotom Ultradünnschnitte angefertigt worden, die i.d.R. eine Schichtdicke von 80 nm aufwiesen. Hierfür wurden Glasmesser verwendet, die zuvor mit einem Knifemaker aus Glasstreifen gebrochen wurden.

Als Objektträger wurden für die TEM G300 Nickel-Trägernetze (Grids) mit einem Durchmesser von 3,05 mm und quadratischen Fenstern verwendet, die zuvor mit 0,5 % (w/v) Lösung von Formvar in wasserfreiem Chloroform beschichtet worden sind.

Nachdem die Grids mit den Ultradünnschnitten beladenen worden sind, mussten die Proben kontrastiert werden. Biologische Proben enthalten i.d.R. viel Kohlenstoff, aber relativ wenig Elemente höherer Ordnungszahl. Je schwerer die Elemente sind, desto stärker sind die Wechselwirkungen der beschleunigten Elektronen und damit auch der sichtbare Kontrast. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Proben sind mit 4 % (w/v) Uranyl-Acetat gelöst in H2OMillipore für 3 min kontrastiert worden, anschließend wurde überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapier vorsichtig abgesaugt. Die Uranyl-Acetat-Lösung wurde zuvor für 10 min mit 13,000 upm (17,200 × g) bei RT abzentrifugiert, um ungelöstes Schwermetallsalz zu präzipitieren. Die Proben wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV mikroskopiert.

2.6.3.3 Ermittlung der Quantität an ICM pro Zelle – Der Quotient ICM pro Zelle Um zu untersuchen, ob die Quantität an ICM in den Zellen von der Kohlenstoffquelle abhängt, wurden Zellkulturen von G. oxydans 621H in Standard-Medium (Kap. 2.2) angezogen, dem Mannitol oder Glycerol in den definierten Konzentrationen von 0,1, 0,5 und 1,0 Mol/Liter zugegeben wurde. Nach 8 h, 24 h und 48 h sind die Kulturen geerntet und für die Elektronenmikroskopie vorbereitet worden (Kap. 2.6.3). An jeweils drei unabhängig voneinander angefertigten Dünnschnitten wurden für jede Probe insgesamt ca. 1500 Zellen auf ICM-Strukturen hin untersucht. Hierbei wurde zwischen Zellen, die eine eindeutig zu identifizierende ICM aufwiesen und Zellen, in denen mögliche ICM-Strukturen vorhanden waren, unterschieden. Den erstgenannten wurde der Wert 1, den

letzteren der Wert 0,5 zugewiesen. Der auf diese Weise ermittelte Gesamtwert wurde durch die Anzahl an untersuchten Zellen geteilt. Das Ergebnis ist ein Quotient aus der Anzahl an Zellen die ICM aufwiesen und der Gesamtzahl an untersuchten Zellen [ICM/Zelle]. Der besseren Übersicht halber wurden die Ergebnisse in Prozent umgerechnet und werden in dieser Weise in Kap. 3.1.2 vorgestellt.

2.6.3.4 Immunogold-Markierung von Ultradünnschnitten mit IgG-Antikörpern Es sind polyklonale Antikörper gegen die membrangebundene PQQ-abhängige Polyol-Dehydrogenase GOX0854 und die große Untereinheit der Quinol-Oxidase des bo3-Typs GOX1912 hergestellt worden (2.5.5). Diese wurden für Western Blot-Analysen und zur Lokalisierung der entsprechenden Enzyme in situ mittels Immunogold-Markierung und anschließender TEM eingesetzt. Die Proben wurden wie in den Kapiteln 2.6.3.1 und 2.6.3.2 beschrieben vorbereitet. Nachdem die Ultradünnschnitte auf die Grids geladen wurden, sind sie allerdings zunächst mit der beladenen Seite nach unten auf PBS-Tropfen (ca. 50 µl) gelagert worden, um eine Austrocknung der Probe zu vermeiden. Dies könnte die erwünschte Wechselwirkung zwischen den Epitopen der Antigene und der entsprechenden Antikörper beeinträchtigen. Damit sich während der folgenden Weiterbehandlung der Proben die Konzentrationen innerhalb der Tropfen (ca.

50 µl) nicht durch Verdunsten erhöhten, wurden während der längeren Inkubationsschritte die Tropfen mit einem Deckel abgedeckt, unter dem sich zusätzlich mit Wasser getränktes Filterpapier befand. Um unspezifische Bindungsstellen an den Ultradünnschnitten zu blocken wurden die beladenen Grids zunächst auf jeweils einem Tropfen Blockierlösung für 30 min bei RT inkubiert. Im Falle des GOX0854-Strep Antikörpers betrug die Konzentration der Blockierlösung 5 % (v/v), des GOX1912 Antikörpers 1 % (v/v), jeweils gelöst in PBS. Zwischen der Lagerung und dem Blockieren ist das an dem Grid mit dem Ultradünnschnitt verbliebene PBS mit einem Filterpapier abgesaugt worden, ein Vorgang, der im Folgenden zwischen jedem einzelnen Schritt durchgeführt wurde. Nach dem Blocken wurden die Proben für 2 h bei RT mit einer Lösung des primären Antikörpers mit einer Verdünnung von i.d.R. 1:1000 inkubiert, Abweichungen sind ggf. angegeben. Der GOX0854-Strep Antikörper wurde in einer 2 %igen Blockierlösung (v/v) verdünnt, der GOX1912 Antikörper in PBS.

Nach dem Ablauf der 2 h wurden die Proben für jeweils 5 min dreimal auf PBS-Tropfen gelegt, das 0,01 % (v/v) Tween 20 enthielt, dem sich 5 min auf einem reinen PBS-Tropfen anschlossen, bevor die Proben für 1 h auf PBS-Tropfen mit dem zweiten Antikörper

inkubiert wurden. Dieser Antikörper ist gegen Kaninchen-Antikörper gerichtet und mit 10 nm großen Goldpartikeln konjugiert, die, betrachtet man die Größe von IgG Antikörpern von ca. 10 nm (WERNER, 1972), in einem Radius von max. 30 nm um das Epitop des Zielproteins zu erwarten sind. Der sekundäre Antikörper wurde jeweils im Verhältnis von 1:80 mit 2 %iger Blockierlösung (v/v) verdünnt, der GOX1912 Antikörper in PBS.

Die Proben wurden analog zu den ersten Waschschritten behandelt, gefolgt von dem Entsalzen der Ultradünnschnitte, wobei die Proben jeweils zweimal kurz auf H2OMillipore-Tropfen gelegt wurden. Nach dem abschließenden Absaugen wurden die Grids mit den Ultradünnschnitten nach oben auf Filterpapier getrocknet und anschließend mit Uranyl-Acetat kontrastiert (2.6.3.2). Die Proben wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV mikroskopiert.