2.4 Genetische Methoden
2.4.4 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR ermöglicht spezifische DNA-Fragmente aus einem komplexen DNA-Gemisch enzymatisch zu amplifizieren (MULLIS et al., 1987). Doppelsträngige DNA wird durch Erhitzen auf 94-96 °C in einzelsträngige DNA überführt (Denaturierung). Durch Absenken der Temperatur können sich zwei Oligonukleotid-Primer an komplementäre Abschnitte der Matrizen-DNA anlagern. Die Oligonukleotid-Primer werden so ausgewählt, dass sie die zu amplifizierende Region flankieren. Im dritten Schritt der PCR werden die beiden Primer mit Hilfe einer thermostabilen Polymerase bei ihrem Temperaturoptimum komplementär zur ursprünglichen doppelsträngigen DNA verlängert (Elongation). Zur Amplifikation wird eine bestimmte Anzahl an Zyklen in einem Thermocycler durchgeführt, wodurch die von den Primern flankierte Region exponentiell akkumuliert wird. Die Anlagerungs-Temperatur wird dabei so gewählt, dass sie ca. 5 °C unter der Schmelztemperatur TS der verwendeten Primer liegt. Hierfür gilt die Näherung: TS [°C] = (2 x (A + T) + 4 x (C + G)).
Die Elongationszeit hängt von der Größe des erwarteten Produktes ab; sie beträgt mindestens 1 min pro 1000 Basenpaare im Falle der Taq-Polymerase, während die Phusion-Polymerase im Vergleich mit doppelter Geschwindigkeit synthetisiert. Der Erfolg der Amplifikation wird mittels Gelelektrophorese im Agarosegel überprüft (2.4.5).
Grundschema der angewendeten PCR-Programme
Reaktion Temperatur Dauer
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min
Denaturierung 95 °C 1 min
25 Zyklen
Anlagerung 50-65 °C 1 min
Elongation 72 °C Nach Bedarf
Abschließende Elongation 72 °C 10 min
Abkühlen und Lagerung 12 °C Nach Bedarf
50 µl PCR-Ansatz mit der Taq-Polymerase 5 µl 10 × Taq-ThermoPol Puffer
1 µl dNTP-Mix (10 mM)
5 µl Vorwärts-Primer (5 pmol/µl) 5 µl Rückwärts-Primer (5 pmol/µl) 2 µl Matrizen-DNA (ca. 50 ng/µl) 0,25 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) 31,75 µl H2OMillipore
2.4.4.1 Colony-PCR
Die Colony-PCR diente zur Überprüfung rekombinanter E. coli oder G. oxydans Klone.
Dazu wurde eine möglichst geringe Menge Zellmaterial gut gewachsener Kolonien der zu überprüfenden Klone mit einem sterilen Zahnstocher von der Agarplatte abgenommen und in ein PCR-Gefäß, gefüllt mit 25 µl Master-Mix, überführt. Nach erfolgter Amplifikation wurde der Erfolg der Colony-PCR durch Gelelektrophorese im Agarosegel überprüft (2.4.5).
2.4.4.2 Overlap Extension PCR
Die translationale Fusion von Proteinen wurde durch Overlap Extension PCR (OEPCR) nach WURCH et al. (1998) durchgeführt. Dabei ist es möglich, ohne die Verwendung von Restriktionsenzymen ein chimärisches Gen zu kreieren, das nur aus den gewünschten Ausgangsgenen besteht, die direkt verknüpft sind. Die OEPCR läuft in drei Schritten ab: das Amplifizieren der Fragmente, deren Fusion und die Amplifikation des Fusionsprodukts. Zwischen den einzelnen Schritten wurden die PCR-Produkte aufgereinigt (2.4.3), einer Agarosegelelektrophorese unterzogen (2.4.5) und bei Bedarf mittels Gelextraktion (2.4.3) isoliert.
Amplifizieren der Fragmente
In zwei getrennten Reaktionen werden das Fragment 1, welches letztendlich für die N-terminale Hälfte des Fusionsproteins codiert, und das Fragment 2 für die anschließende Fusion amplifiziert (Abb. 2.4.1.). Der Rückwärts-Primer des DNA-Fragments 1 (Arev,) und der Forward-Primer des Fragments 2 (Bfwd) sind in ihrem jeweiligen 5‘-Bereich komplementär zueinander. Diese Komplementarität ist die Grundlage der Fusion der beiden Fragmente im zweiten Schritt. Der komplementäre Bereich sollte mindestens 12 Nukleotide umfassen (WURCH et al., 1998), gefolgt von einem mindestens 21 Nukleotide langen Abschnitt komplementär zu der Sequenz, die zu amplifizieren ist.
Der überlappende Bereich der Primer wurde im Rahmen dieser Arbeit auf 30 Nukleotide ausgedehnt.
Abb. 2.4.1.: Das Amplifizieren der Fragmente
Die Abbildung zeigt schematisch den Ablauf der ersten PCR-Reaktionen der Overlap Extensin PCR. In zwei getrennten Reaktionen werden den zu fusionierenden DNA-Fragmenten komplementäre Überhänge angehängt, die in der folgenden PCR-Reaktion zur Fusion genutzt werden.
Programm Fragment-Amplifikation
Reaktion Temperatur Dauer
Initiale Denaturierung 98 °C 60 s
Denaturierung 98 °C 30 s
10 Zyklen
Anlagerung 70 °C 60 s
Elongation 72 °C Nach Bedarf
Abschließende Elongation 72 °C 10 min
Abkühlen und Lagerung 12 °C Nach Bedarf
Die Denaturierung dieses ersten PCR-Schrittes sollte die 30 s nicht überschreiten, um eine Degradierung der an den 5‘-Enden überhängenden Nukleotide zu vermeiden (WURCH et al., 1998).
50 µl PCR-Ansatz mit der Phusion-Polymerase - Fragment-Amplifikation 10 µl 5x Phusion-GC-Puffer
1 µl dNTP-Mix (10 mM)
5 µl Vorwärts-Primer (5 pmol/µl) 5 µl Rückwärts-Primer (5 pmol/µl) 1 µl Matrizen-DNA (ca. 100 ng/µl) 0,5 µl Phusion-Polymerase (2 U/µl) 27,5 µl H2OMillipore
Fusion der Fragmente
Im Verlauf dieser PCR werden die Fragmente fusioniert. Die komplementären 3‘-Überhänge dienen nach der Denaturierung der Fragmente als Primer für die Elongation durch die Polymerase (Abb. 2.4.2.). Die lange Anlagerungszeit verbessert die Basenpaarung der komplementären Bereiche der Fragmente, die hier fusioniert wurden. Nach der Aufreinigung der Fragmente (2.4.3) und dem Bestimmen der DNA-Konzentration (2.4.6) konnte anhand der Fragmentlängen die eingesetzten Volumina an Fragmentlösungen ermittelt werden, um beide Fragmente in äquimolarem Verhältnis im PCR-Ansatz zu haben.
Abb. 2.4.2.: Die Fusion der Fragmente
Die Abbildung zeigt schematisch den Ablauf der PCR-Reaktion, in der die beiden DNA-Fragmente der ersten Reaktionen fusioniert werden. Hierbei dient der jeweilige 3‘-Überhang als Primer für die DNA-Polymerase.
Programm Fragment-Fusion
Reaktion Temperatur Dauer
Initiale Denaturierung 98 °C 60 s
Denaturierung 98 °C 20 s
10 Zyklen
Anlagerung 55 °C 25 min
Elongation 72 °C 100 s
Abschließende Elongation 72 °C 10 min
Abkühlen und Lagerung 12 °C Nach Bedarf
50 µl PCR-Ansatz mit der Phusion-Polymerase - Fragment-Fusion 10 µl 5x Phusion-GC-Puffer
2 µl dNTP-Mix (10 mM)
10 µl DNA-Fragmente (10 - 100 ng/µl) 0,5 µl Phusion-Polymerase (2 U/µl)
27,5 µl H2OMillipore
Das nach der Fusion aufgereinigte Produkt wurde mittels Speed-Vac pelletiert und in 28,5 µl H2OMillipore resuspendiert, um vollständig für die erfolgte Amplifikation eingesetzt werden zu können.
Amplifikation des Fusionsprodukts
Das Fusionsprodukt wurde in einem letzten PCR Schritt mit den außen liegenden Primern amplifiziert (Afwd und Brev, Abb. 2.4.3.). Das PCR-Programm wurde für eine höhere Ausbeute an Fusionsprodukt modifiziert, statt 10 sind 25 Zyklen durchgeführt worden.
Abb. 2.4.3.:
Amplifikation des Fusionsprodukts
Die Abbildung 2.3. zeigt den letzten Schritt der Overlap Extension PCR, der im Prinzip einer normalen PCR entspricht.
Mit Hilfe der Primer Afwd und Brev, die auch schon in den ersten PCR-Reaktionen zur Amplifikation der Fragmente benutzt worden sind, wird das Fusionsprodukt vervielfältigt.
Programm Amplifikation des Fusionsproduktes
Reaktion Temperatur Dauer
Initiale Denaturierung 98 °C 30 s
Denaturierung 98 °C 20 s
25 Zyklen
Anlagerung 70 °C 60 s
Elongation 72 °C 160 s
Abschließende Elongation 72 °C 10 min
Abkühlen und Lagerung 12 °C Nach Bedarf
50 µl PCR-Ansatz mit der Phusion-Polymerase - Amplifikation Fusionsprodukt 10 µl 5x Phusion-GC-Puffer
1 µl dNTP-Mix (10 mM)
5 µl Vorwärts-Primer (5 pmol/µl)
5 µl Rückwärts-Primer (5 pmol/µl) 28,5 µl Fusions-Produkt (100 ng/µl)
0,5 µl Phusion-Polymerase (2 U/µl)