4.7 Validierung der Kandidatengene des Microarrays
4.7.1 Technische Validierung aus den RNA-Proben des Microarrays
In einem ersten Validierungsschritt sollte überprüft werden, ob sich die Art und das Ausmaß der Regulationen der Gene reproduzieren lässt. Dafür wurden die RNA-Proben des Arrays für die Durchführung individueller Bestimmungen der Expressionsspiegel pro Gen in der qPCR herangezogen. Hierzu wurde mRNA aus den RNA-Proben in cDNA umgeschrieben und in der qPCR unter Verwendung spezifischer Primer die Expressionsspiegel für einzelne Gene bestimmt.
Anders als bei der Berechnung im Microarray erfolgte die Berechnung der Spiegel hier unter Bezug auf Referenzgene. Die Expression in der Bedingung siLuciferase wird jeweils als 1 definiert. Abbildung 23 (A) und Abbildung 23 (B) zeigen beispielhaft die Auswertungen zweier Kandidatengene des Microarrays. CCL5, das im Microarray eine Heraufregulation zeigte, weist auch hier in allen Relationen eine deutliche Erhöhung der Transkriptspiegel auf. RGS2, ein Gen das im Microarray durch PRMT1-Depletion weniger stark exprimiert war, ist auch in der technischen Validierung herunterreguliert. Wie auch im Microarray (nicht gezeigt) sind hier einzelne Relationen, wie siPRMT1_6 zu siNon5, nur knapp über der Signifikanzschwelle reguliert.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Relative, normalisierte Expression
CCL5-Transkriptspiegel
GAPDH S14 RPLP0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Relative, normalisierte Expression
RGS2-Transkriptspiegel
GAPDH S14 RPLP0
Abbildung 23: Technische Validierung von Kandidatengenen aus dem Microarray
Die RNA-Proben des Arrays (Abbildung 21) wurden in einer reversen Transkription in cDNA umgeschrieben und daraus die relativen Transkriptmengen in der qPCR mit Hilfe spezifischer Primer bestimmt. Die Spiegel sind relativ zu denen in der Bedingung siLuciferase angegeben. Zur Normalisierung wurden GAPDH als Gen des Energiestoffwechsels der Zelle und S14 und RPLP0 als ribosomale Bestandteile verwendet. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwerts an, der aus einem Messtriplikat errechnet wurde.
A B
Ergebnisse
116 Tabelle 2 listet die stichprobenartige technische Validierung von Kandidatengenen des Microarrays auf und stellt die absoluten Regulationen im Array denen gegenüber, die in den qPCRs ermittelt wurden. Auf die Durchführung dieser Validierung für alle Kandidatengene des Microarrays wurde zugunsten weiterer, biologisch unabhängiger Experimente verzichtet. Mit Ausnahme der Gene AHNAK und NSD1 decken sich die Ergebnisse der qPCRs gut mit den Expressionswerten, wie sie im Array ermittelt worden waren. Bei den heraufregulierten Genen weichen lediglich die absoluten Werte ab, was vermutlich in den Gegebenheiten der qPCR-Methode begründet liegt. Beispielsweise führt die Tatsache, dass die Primereffizienzen von 100 Prozent abweichen können, zu über- oder unterrepräsentierten Expressionsänderungen.
Die Effizienz der Primer wurde im Experiment allerdings nicht bestimmt und entsprechend fand keine Korrekturberechnung dahingehend statt. Zudem resultiert der Bezug auf die Mischreferenz im Array notwendigerweise in leicht abweichenden Regulationen in der RT-qPCR, da in letzterer zwei Expressionen direkt miteinander verglichen werden, ohne sich dabei auf eine durchschnittliche Expression zu beziehen.
Gen Fache Regulation
im Microarray
Fache Regulation in
technischer Validierung (qPCR)
AHNAK * 0,4 0,9
CCL5 8,5 10,7
GLIPR1 0,3 0,3
HERC5 8,5 10,6
IFI44 4,1 5,5
ISG15 3,3 5,6
NSD1 * 0,1 1,3
PRMT1 0,1 0,1
RGS2 0,4 0,4
Tabelle 2: Gegenüberstellung der Transkriptspiegel-Regulationen einzelner Kandidatengene im Microarray mit deren technischer Validierung
Neun Kandidatengene des Microarrays wurden stichprobenartig einer technischen Validierung mittels qPCR unterzogen, wie in Abbildung 23 gezeigt. Die dritte Spalte listet die Ergebnisse in der Relation siPRMT1_UTR1 zu siLuciferase bei Normalisierung auf RPLP0 auf. Die zweite Spalte zeigt die Regulationen im Microarray in derselben Relation unter Verwendung der Mischreferenz als Bezug, wie in Abbildung 20 dargestellt. (*) markiert Kandidatengene, deren technische Validierung von den Ergebnissen des Microarrays stark abweicht.
Ergebnisse
117 Die Reproduktion kann auf dieser Ebene als erfolgreich angesehen werden. Für die beiden nicht validierbaren Gene AHNAK und NSD1 gilt, dass in beiden Fällen mehrere verschiedene Sondensequenzen auf dem Array gespottet waren. Eine Auswertung dieser hat ergeben, dass jeweils nur eine der vorhandenen Sonden eine Expressionsänderung anzeigte, die zur Klassifizierung des Gens als reguliert führte. Die verbleibenden Sonden wiesen keine Veränderung der Spiegel auf, so wie es auch in der technischen Validierung nicht der Fall war.
Das Gen wurde in solchen Fällen vorerst als nicht reguliert angenommen. Die Gründe und Konsequenzen dieser Gegebenheiten werden im Kapitel Diskussion erläutert.
Tabelle 3 enthält eine komplette Auflistung von Kandidatengenen, die in verschiedenen Sonden teils widersprüchliche Expressionswerte im Microarray aufwiesen. Die meisten dieser Gene wurden von der weiteren Validierung in dieser Arbeit ausgeschlossen. Es sind die Funktionen der jeweiligen Genprodukte sowie Angaben zu den Gegebenheiten im Array aufgeführt. Bei KCNH2 und PPP2R2B wies die Auswertung der Arraydaten Auffälligkeiten bezüglich der Expressionswerte auf. Hierbei befanden sich alle Expressionen der Einzelbedingungen unterhalb der Mischreferenz. In Absprache mit dem zuständigen Bioinformatiker Florian Finkernagel wurden diese Regulationen als unspezifisch angesehen. Da jedoch keine Erklärung für das Phänomen gegeben werden kann, sollten diese Gene von zukünftigen Validierungen nicht ausgeschlossen werden.
Gen Regulation im
Microarray
Funktion des Proteins Quellen Ergebnisse verschiedener Sonden AHNAK Herunter Zell-Zell-Adhäsion
Interaktion mit ANNEXIN A2
Positive Regulation von Invasion und Migration
Regulation von E-CADHERIN
[8,21,269, 273]
3 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 2 Sonden ohne Regulation CEACAM1 Herauf Interferon-induzierbar
Adhäsionsmolekül
Interaktion mit ANNEXIN A2
In vielen Tumoren dereguliert
Faktor für Metastasierung
[37,81, 138,150, 293]
2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde ohne Regulation
CMPK2 Herauf Nukleotidsynthese [315] 2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde ohne Regulation GPRIN2 Herauf Rolle in G-Protein-Signalgebung
Interagiert mit HOXA1 (im Yeast Two-Hybrid-System)
[43,125, 161]
3 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 2 Sonden ohne Regulation
Ergebnisse
118
GRASP Herauf Guanidin-Austauschfaktor
Reguliert Signalgebung durch ARF-GTPasen
Wichtig für Zellmotilität
[151,167, 310]
2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde ohne Regulation HIP1R Herauf Wichtig in CLATHRIN-vermittelter
Endozytose
Essenziell für Chromosomen-Segregation
Induziert Apoptose über BAK/CASPASE 9
Rolle im EGFR-Recycling
[77,146, 156,230]
4 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 2 Sonden mit schwacher Regulation, 1 Sonde ohne Regulation KCNH2 Herauf Kalium Ionenkanal
Verstärkte Expression in Karzinomen
Pro-proliferativ in Leukämien
[130,278, 279]
Unklare Regulation bei beiden vorhandenen Sonden MFI2 Herauf Wichtig für Invasivität und Metastasierung
von Melanomen
Chemotaxisfaktor für Endothelzellen
Fördert Angiogenese
Induziert durch VEGF
Pro-proliferativ
[25,72, 197,256, 259,284]
2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde ohne Regulation NSD1 Herunter Durch H3K36-Methylierung Einfluss auf
Acetylierung von HoxA Genen und Proto-Onkogenen
Induziert Leukämien
Rolle in Rekrutierung und Phosphorylierung der RNA Polymerase II
Einfluss auf Serumabhängigkeit des Zellwachstums
[91,184, 318]
3 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 2 Sonden ohne Regulation
PPP2R2B (B55β UE von PP2A)
Herauf Holoenzym inhibiert die PRMT1-Aktivität
Pro-apoptotisch
Dephosphoryliert CHK2 bei DNA-Schaden
Rolle in Zell-Zell-Adhäsion
Dephosphoryliert Mdm2 und HDM2
Gen ist in Brustkrebs methyliert
Inhibiert Eintritt in Mitose
Destabilisiert c-MYC
[65,73, 172,205, 212,224, 286,287]
2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation aber mit Auffälligkeiten, 1 Sonde ohne Regulation
RSAD2 (Viperin)
Herauf Interferon-induzierbar [82] 2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde ohne Regulation SSC5D Herauf Glykoprotein, mutmaßliche Funktion in
angeborener Immunantwort
Maus-Homolog wird in Pankreas-Azinus-Zellen exprimiert
[98,201] 2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde ohne Regulation TTC39B Herauf Keine Funktionen bekannt. SNP-Analyse
zeigte Assoziation mit Blutcholesterin-Konzentration.
[141] 2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde mit schwacher Regulation
Ergebnisse
119
XAF1 Herauf Rolle in Interferon-induzierter Apoptose
In Pankreaskrebs und mehreren anderen Tumorarten herunterreguliert
Aktiviert p53 Transaktivierungsaktivität
Zellzykluskontrolle, induziert G2/M-Arrest
Inhibiert Angiogenese und Migration
[14,46,56, 122,163, 176,196, 242,301, 332]
2 Sonden;
1 Sonde mit Regulation, 1 Sonde ohne Regulation