3.2 Mikrobiologische und Molekularbiologische Methoden
3.2.6 RT-qPCR
Mit Hilfe der RT-qPCR (reverse Transkription – quantitative Polymerase-Kettenreaktion) kann die in der Zelle vorliegende Menge einer bestimmten mRNA relativ bestimmt werden. Bei dem hier verwendeten Verfahren werden Mengen bestimmt, die relativ zu einem Bezugswert angegeben werden. So lassen sich beispielsweise Expressionsunterschiede nach einer Stimulation im Vergleich zu unbehandelten Zellen ermitteln.
Material:
RNA-Aufreinigungskit (Seqlab)
DNase-Kit (Peqlab)
Oligo-dT-Primer für die reverse Transkription
Reverse Transkriptase Kit (Invitrogen) mit 0,1 M DTT Stock und „First Strand“
Reaktionspuffer
„RiboLock“ RNase-Inhibitor
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
qPCR SYBR-Green-Mix-Kit (Thermo Scientific)
Nukleasefreies Wasser
spezifische Primer für die qPCR Durchführung:
Die Durchführung dieser Methode umfasst mehrere Einzelprotokolle und erfolgt in drei Schritten.
1. Gewinnung der RNA
Das Kulturmedium wird von den adhärenten Zellen abgenommen. In einem Restvolumen werden die Zellen abgeschabt und in ein 1,5 ml-Reagiergefäß überführt. Nach zehnsekündiger
Methoden
75 Zentrifugation bei 17.000 g wird das Pellet im Lysispuffer des RNA-Mini-Kits aufgenommen. Ein Waschen der Zellen findet zuvor nicht statt.
Der weitere Ablauf der RNA-Aufreinigung richtet sich nach dem Protokoll des Herstellers. Als zusätzlicher Schritt wird ein DNA-Verdau durchgeführt, sobald die Nukleinsäuren auf den Säulen gebunden wurden. Hierzu wird 1 µl DNase in 45 µl DNase-Verdaupuffer (jeweils aus dem DNase-Kit) pro Säule zugegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wird mit den Waschschritten des Protokolls fortgefahren.
Nach Elution der RNA von den Säulen wird diese kurz bei -20 °C eingefroren und nachfolgend die RNA-Konzentration im Nano-Drop gemessen.
Wird bei einem Experiment sowohl Protein, als auch RNA gewonnen, so erfolgt dies grundsätzlich von derselben Platte oder aus demselben Pool mehrerer zugleich geernteter Platten. Dabei wird für die RNA-Ernte ein kleiner Teil des Gesamtvolumens abgenommen.
Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse beider Methoden (Expressionsspiegel auf Protein- und Transkriptebene) direkt vergleichbar sind.
2. Reverse Transkription
Bei der beschriebenen Extraktionsmethode wird Gesamt-RNA aus den Zellen gewonnen. Der darin enthaltene Anteil an mRNA wird nun mit Hilfe eines oligo-dT-Primers in cDNA umgeschrieben.
Nach der Messung der RNA-Konzentration im Nano-Drop (3.2.4) werden zwischen 0,2 und 2 µg Gesamt-RNA in ein Mikroreagiergefäß pipettiert. Pro Ansatz wird nach folgendem Schema pipettiert:
0,2 - 2 µg RNA (gemäß Nano-Drop)
ad 10 µl nukleasefreies Wasser
5 µl dNTP/oligo-dT-Mix
bestehend aus: 1 µl dNTPs (10 mM je dNTP)
1 µl oligo-dT-Primer (0,5 µg/µl Stocklösung) 4 µl nukleasefreies Wasser
Nach Vermischen dieser Komponenten wird für fünf Minuten auf 65 °C erwärmt, um Sekun-därstrukturen aufzubrechen und anschließend auf 4 °C abgekühlt, wobei die Anlagerung der Primer stattfindet. Die Ansätze werden aus dem Thermocycler entnommen und weitere Komponenten zugegeben. Die Zugabe der reversen Transkriptase muss nach dem Anlagern der Primer stattfinden, da das Enzym nicht hitzestabil ist. Den Ansätzen werden 10 µl Mix mit
Methoden
76 folgenden Einzelkomponenten zugegeben (Angaben pro Ansatz, teilweise aus dem Kit für die reverse Transkription):
0,7 µl reverse Transkriptase
0,5 µl „RiboLock“ RNase-Inhibitor
5 µl „First Strand“ Reaktionspuffer
2 µl DTT (0,1 M Stocklösung)
2 µl nukleasefreies Wasser
Die reverse Transkriptase, der „First Strand“ Reaktionspuffer und DTT stammen aus dem reverse Transkriptase Kit (Invitrogen). Die Ansätze werden für eine bis zwei Stunden bei 37 °C und anschließend für 15 Minuten bei 75 °C inkubiert. Nach Abschluss des Prozesses wird die cDNA im Verhältnis 1:12 mit nukleasefreiem Wasser verdünnt und bei -20 °C gelagert.
3. qPCR Lauf
Von der verdünnten cDNA werden jeweils 6 µl pro Bedingung in Triplikaten in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte vorgelegt. Zuletzt werden 19 µl des folgenden Mixes zugegeben:
1 µl Primer-Mix (enthält sense und antisense primer, mit jeweils 50 pmol/l)
8 µl nukleasefreies Wasser
12 µl SYBR-Green-Mix (enthält dNTPs, SYBR-Green, Polymerase und Hilfsstoffe)
ROX Referenzfarbstoff (aus dem qPCR-Reaktionskit) im Volumenverhältnis 1:30.000 Nach luftdichtem Verschluss der Platte durch Hitzeverklebung wird der Lauf im qPCR-Cycler mit folgendem Temperaturprogramm gestartet:
Aktivierung der Polymerase: 95 °C, 15 Minuten
Auftrennung der DNA-Doppelstränge: 95 °C, 20 Sekunden
Primeranlagerung und Strang-Polymerisation: 60 °C, 30 Sekunden
Die Messung der Absorptionen von SBYR-Green und ROX erfolgt am Ende jedes Polymerisa-tionsvorgangs. Je nach eingesetzten Primern werden zwischen 25 und 55 Zyklen verwendet.
Bei jedem Lauf wird eine Schmelzkurve (55 °C bis 95 °C) zur Beurteilung der Primerspezifität angefertigt.
Bei der Messung der Absorption durch SYBR-Green besteht ein Hintergrundrauschen, das erst ab einem bestimmten Zyklus klar überschritten wird. Dieser Zyklus-Wert wird Ct-Wert (cycle threshold) genannt und von der Software des qPCR-Gerätes anhand einer Amplifikationskurve X Zyklen
Methoden
77 errechnet, welche die Absorption in Abhängigkeit von der Zyklenzahl darstellt. Je früher der Messhintergrund überschritten wird, also je geringer der Ct-Wert ist, desto mehr Moleküle der betreffenden mRNA haben entsprechend in der Probe zu Beginn der Amplifikation vorgelegen.
Vergleicht man die Ct-Werte zwischen zwei Behandlungszuständen einer Zelllinie, so kann ein eventueller Expressionsunterschied der betrachteten mRNA errechnet werden.
Geringe Abweichungen in den eingesetzten Mengen an cDNA (beispielsweise durch Pipettierungenauigkeiten oder unterschiedliche Effizienzen bei der reversen Transkription) werden durch Einbezug eines Normalisierungsgens verrechnet. Dabei wird die ΔΔCt-Methode verwendet, um Expressionsunterschiede zwischen verschiedenen Bedingungen zu errechnen, wobei gleichzeitig die Normalisierung, z. B. auf das Gen GAPDH, einbezogen wird:
𝛥𝛥𝐶𝑡 = 𝛥𝐶𝑡(𝐵𝑒𝑑𝑖𝑛𝑔𝑢𝑛𝑔 2) − 𝛥𝐶𝑡(𝐵𝑒𝑑𝑖𝑛𝑔𝑢𝑛𝑔 1) 𝑚𝑖𝑡: 𝛥𝐶𝑡 = 𝐶𝑡(𝑢𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑢𝑐ℎ𝑡𝑒𝑠 𝐺𝑒𝑛) − 𝐶𝑡(𝑁𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑢𝑛𝑔𝑠𝑔𝑒𝑛)
Hierbei wird Bedingung 2 auf Bedingung 1 bezogen. Die Expression von Bedingung 1 wird bei der graphischen Darstellung zur Vereinfachung meist als 1 definiert. Die Differenz der Ct-Werte in Form des ΔΔCt-Wertes wird in eine fache Induktion der Expression umgerechnet. Es wird hierbei vereinfachend davon ausgegangen, dass durch eine Primereffizienz von 100 % (wird nicht nachgewiesen) eine Verdopplung der cDNA-Menge pro Zyklus erreicht wird:
𝐹𝑎𝑐ℎ𝑒 𝐸𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠𝑖𝑜𝑛 = 2𝛥𝛥𝐶𝑡
Für die Berechnungen werden die Ct-Mittelwerte der Messtriplikate verwendet.
Die Fehlerwerte in Form der Standardabweichung des Mittelwerts werden als Balken in den Diagrammen angegeben. Da die Ergebnisse zweier Messungen (untersuchtes Gen und Normalisierungsgen) einbezogen werden, erfolgt eine Verrechnung der beiden einzelnen Standardabweichungen nach dem Prinzip der Fehlerfortpflanzung gemäß folgender Formel:
𝑆𝑡𝑎𝑏𝑤 = 2𝛥𝛥𝐶𝑡∗ 𝑙𝑛2 ∗ √𝑆𝑡𝑎𝑏𝑤(𝑢𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑢𝑐ℎ𝑡𝑒𝑠 𝐺𝑒𝑛)2+ 𝑆𝑡𝑎𝑏𝑤(𝑁𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑢𝑛𝑠𝑔𝑒𝑛)2 Die Standardabweichungen der einzelnen Gene werden dabei jeweils aus den Messtriplikaten ermittelt.
Methoden
78 Berechnung der Anreicherung eines Proteins an einem Bereich der DNA (bei der ChIP)
Um eine Aussage über die Anreicherung eines Proteins an einer bestimmten DNA-Region (3.1.13) treffen zu können, wird die totale Menge dieser Region im Input, also in der Chromatinlösung vor Durchführung der IP, ebenfalls in der qPCR gemessen. Da die DNA hier deutlich höher konzentriert ist, wird lediglich 1 % der Chromatinmenge der IPs eingesetzt.
Dieser Umstand wird bei den späteren Berechnungen berücksichtigt.
Die Differenz zwischen den Ct-Werten des Inputs und einer IP-Bedingung wird nach folgender Formel in einen prozentualen Wert umgerechnet und graphisch dargestellt:
𝐴𝑛𝑟𝑒𝑖𝑐ℎ𝑒𝑟𝑢𝑛𝑔 𝑖𝑛 % = 2𝐶𝑡(𝐼𝑛𝑝𝑢𝑡)−𝐶𝑡(𝐼𝑃)
Diese Formel gilt bei Einsatz von einem Prozent Input zur Durchführung der qPCR. Die eingesetzten Ct-Werte entsprechen den Mittelwerten der Triplikate. Die Standardabweichun-gen werden in der graphischen Darstellung als positive und negative Fehlerbalken angegeben und analog zur RT-qPCR nach folgender Formel berechnet:
𝑆𝑡𝑎𝑏𝑤 = 2𝐶𝑡(𝐼𝑛𝑝𝑢𝑡)−𝐶𝑡(𝐼𝑃)∗ 𝑙𝑛2 ∗ √𝑆𝑡𝑎𝑏𝑤(𝐼𝑛𝑝𝑢𝑡)2+ 𝑆𝑡𝑎𝑏𝑤(𝐼𝑃)2
Für die RT-qPCR und die ChIP-qPCR gilt, dass in Einzelfällen offensichtliche Fehlmessungen aus den Triplikaten ausgeschlossen werden und die Mittelwerte sowie Standardabweichungen aus den verbliebenen beiden Werten berechnet werden. Ein Ausschluss eines Wertes erfolgt nur bei eindeutiger Abweichung nach durchgängig einheitlich angewandten Beurteilungs-grundlagen.
Ergebnisse
79