Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Die Chromatin-Immunpräzipitation wird verwendet, um die Assoziation von Proteinen mit DNA-Abschnitten zu untersuchen.

Zunächst werden Proteine mit der DNA mittels Formaldehyd quervernetzt, um die in der Zelle vorliegenden Protein-DNA-Komplexe zu konservieren. Im Folgenden muss das Chromatin mit geeigneten Methoden in kleine Bruchstücke (optimal sind etwa 500 Basenpaare) zerteilt werden, um später die Interaktion eines Proteins auf einen möglichst beschränkten Abschnitt der DNA eingrenzen zu können. Während Proteine und DNA noch immer quervernetzt sind, erfolgt eine spezifische Anreicherung des zu untersuchenden Proteins mit Hilfe von Antikörpern. Eventuell vom Protein gebundene DNA wird hierbei mit aufgereinigt und kann nach der enzymatischen und hitzevermittelten Abspaltung vom Protein mit Hilfe spezifischer Primer in der qPCR (3.2.6) nachgewiesen werden.

Material:

 Sonikator

 36,5 % Formaldehydlösung

 2,5 M Glycin

 PBS

 ChIP Lysispuffer I (5 mM PIPES pH8, 85 mM KCl, 0,5 % Igepal)

 ChIP Lysispuffer II (10 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl,1 % Igepal, 1 % DOC, 1 mM EDTA) mit 0,3 % / 0,1 % / 0,0 % SDS

 ChIP Waschpuffer I (20 mM TRIS pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % Triton X-100)

Methoden

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 ChIP Waschpuffer II (20 mM TRIS pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % Triton X-100)

 ChIP Waschpuffer III (10 mM TRIS pH 8,0, 1 % Igepal, 1 % DOC, 1 mM EDTA, 250 mM LiCl)

 TE-Puffer (10 mM TRIS pH 8,0, 1 mM EDTA)

 ChIP Elutionspuffer für Sepharose (1 % SDS, 100 mM NaHCO3)

 Reversionspuffer (1,92 M NaCl, 96 mM EDTA, 385 mM Tris pH 6,8, 385 µg/ml Proteinase K, 192 µg/ml RNase A)

 Proteaseinhibitoren Aprotinin, Leupeptin und PMSF (je 10 µg/µl)

 RNase A, 10 mg/ml

 Proteinase K, 20 mg/ml

 Protein A/G-Sepharose

 BSA, 20 mg/ml

 ssDNA-Blocklösung, 4 mg/ml

 DNA-Aufreinigungskit (Qiagen)

 EDTA, 0,5 M

 NaCl, 5 M

 Tris, pH 6,8, 1M

 Ethidiumbromid-Agarosegel Durchführung:

Die Durchführung dieser Methode erstreckt sich über mehrere Tage und ist in verschiedene Abschnitte unterteilt:

1. Chromatin-Isolation mit Quervernetzung von Protein und DNA

Da für die Chromatinisolation eine große Anzahl an Zellen benötigt wird, werden pro Kultur-bedingung mehrere Schalen verwendet und im Verlauf der Ernte zusammengeführt. Bei dem beschriebenen Erntevorgang wird jeweils eine Schale (identische Wachstumsfläche) pro Bedingung separat geerntet und später für die Herstellung von Protein-Gesamtzellextrakt durch IPH-Lyse (3.1.7) und zur Gewinnung von RNA (3.2.6) verwendet. Diese separate Schale wird keiner Quervernetzung unterzogen. Zusätzlich wird anhand dieser die Zellzahl bestimmt.

Sie ist für die Bestimmung der zu verwendenden Volumina für die Zelllyse während der Chromatinherstellung entscheidend.

Zur Quervernetzung von Protein und DNA wird Formaldehyd mit einer finalen Konzentration von einem Volumenprozent zugegeben. Die Inkubation erfolgt für zehn Minuten bei 37 °C oder

Methoden

56 für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktion wird durch Zugabe von Glycin mit einer Endkonzentration von 125 mM und fünfminütige Inkubation abgestoppt. Das Medium sowie das enthaltene Formaldehyd werden abgeschüttet und durch zweimaliges Waschen des Zellrasens mit kaltem PBS entfernt. Hierauf werden die Zellen in einem Milliliter PBS abgeschabt und in ein Falcon überführt. Alle Vorgänge ab diesem Zeitpunkt werden auf Eis bzw. in einer Kühlzentrifuge durchgeführt. Die Zellen werden durch Pelletieren bei 400 g vom PBS befreit. Als nächstes wird das Zellpellet in Lysispuffer I resuspendiert, wobei zwei Milliliter Puffer pro fünf Schalen eingesetzt werden. Dieser Puffer bewirkt ein Lysieren der Zellen, ohne jedoch den Zellkern aufzubrechen. Nach mindestens zehnminütiger Inkubation werden die Zellkerne bei 400 g pelletiert und der Überstand verworfen. Die Kerne werden in Lysispuffer II (0,3 % SDS) aufgenommen. Hierbei wird durch Einsetzen eines entsprechenden Volumens die Zellzahl auf 30 Millionen Zellen pro Milliliter eingestellt. Dies ist entscheidend, um die Vergleichbarkeit von Experimenten zu gewährleisten, da die Effizienz der späteren Sonifizierung des Chromatins auch von der Chromatindichte in der Lösung abhängt. In diesem Puffer werden die lysierten Zellen mindestens zehn Minuten, bei Bedarf aber bis zu zwei Tage, gelagert.

Das Protokoll für die Fragmentierung des Chromatins mittels eines Sonikators variiert leicht zwischen den Experimenten, da für die Wahl der Intensität und Häufigkeit der Pulse auch der Zustand der Sonikatorspitze mit einbezogen werden muss. Es werden jedoch bei allen Experimenten Pulse von einer Sekunde Dauer und einer Pause von drei Sekunden zwischen den Pulsen verwendet. Die Anzahl an Fragmentierungspulsen liegt zwischen 50 und 80 Wiederholungen, während die Amplitude zwischen 20 und 30 Prozent des Maximums eingestellt wird. Es werden Aliquots mit einem Volumen von 500 µl in 15 ml-Falcons für die Sonifizierung eingesetzt. Nach der Sonifizierung wird Zelldebris durch 30-minütige Zentrifugation bei 6.900 g pelletiert und das fragmentierte Chromatin mit den Überständen gewonnen und die Ansätze einer Bedingung vereint.

In einem anschließenden Schritt wird die Qualität der Chromatinfragmentierung geprüft.

Hierfür werden 50 µl des Chromatins einem Proteinverdau mit einem Mikroliter Proteinase K (20 mg/ml) unterzogen. Zusätzlich wird enthaltene RNA durch Zugabe von zwei Mikrolitern RNase A (10 mg/ml) abgebaut. Der Verdau findet für drei Stunden bei 55 °C mit anschließender Inkubation bei 65 °C für mindestens acht Stunden statt.

Danach wird die DNA mittels Affinitätssäulen nach Herstellerprotokoll (Qiagen) aufgereinigt.

Nach DNA-Konzentrationsmessung mittels NanoDrop (3.2.4) werden zwischen 800 und 1500 ng DNA auf ein einprozentiges Agarosegel (3.2.5) aufgetragen. Die Aufteilung der

Methoden

57 aufgetrennten DNA auf verschiedene Größenbereiche wird unter UV-Licht beurteilt. Optimal ist eine Akkumulation in einem Bereich von 500 Basenpaaren. Insofern eine Fragmentierung grundsätzlich stattgefunden hat, also nicht ausschließlich Chromatin im hochmolekularen Bereich vorhanden ist, wird das Experiment unabhängig vom erzielten Ergebnis fortgeführt.

2. Immunpräzipitation

Die Immunpräzipitation findet weitgehend wie in Kapitel 3.1.12 erklärt statt. Vor Beginn des Preclearings wird die SDS-Konzentration der Chromatinlösung durch Zugabe des zweifachen Volumens an Lysispuffer II (0 % SDS) auf 0,1 % angepasst. Die zum Preclearing benutzte Sepharose wird bei dieser Methode zuvor durch zwei- bis zwölfstündige Inkubation mit 1 mg/ml BSA und 400 µg/ml sonifizierter DNA aus Lachssperma (jeweils Endkonzentrationen) in Lysispuffer II (0,1 % SDS) gesättigt. Freies BSA und freie DNA werden nach dem Sättigungsvorgang durch zweimaliges Waschen mit Lysispuffer II entfernt.

Für die Immunpräzipitation werden 5 µg Antikörper pro 75 µg Chromatin verwendet. Für Antikörper, die eine sehr gute Anreicherung zeigen (p53 und H3), wird die Chromatin-Menge auf 30 µg (3 µg α-p53-Antikörper) bzw. 20 µg (1 µg α-H3-Antikörper) reduziert.

Zusätzlich zu den Aliquots für die verschiedenen IPs wird pro Bedingung 1 % des IP-Volumens vom Chromatin (nach Preclearing) abgenommen. Dies dient bei der späteren qPCR als Bezugswert für die totale Chromatinmenge vor Durchführung der IP („Input“).

Nach der Übernachtinkubation der Chromatinlösung mit den Antikörpern und der Immobilisierung der Antikörper-Protein-DNA-Komplexe mit Sepharose für drei Stunden, wird die Sepharose mit den gebundenen Komplexen nach folgendem Schema mit je 1 ml Puffer gewaschen:

 Waschpuffer I, 2x

 Waschpuffer II, 2x

 Waschpuffer III, 4x

 Tris/EDTA, pH8, 2x

Das Waschen erfolgt durch zweiminütiges Rotieren. Alle Zentrifugationen finden bei Raumtemperatur und 6.000 g statt.

3. Auflösen der Quervernetzung von Protein und DNA, Nachweis der DNA durch qPCR Um analysieren zu können, welche DNA-Abschnitte mit dem aufgereinigten Protein verbunden waren, müssen die Protein-DNA-Komplexe zuerst von der Sepharose gelöst und danach die

Methoden

58 Proteinkomponente entfernt werden. Aufgrund des hohen SDS-Gehalts des Elutionspuffers müssen die folgenden Schritte bei Raumtemperatur erfolgen.

Dazu wird die Sepharose nach dem Waschen mit 250 µl Elutionspuffer versetzt, stark gevortext und 20 Minuten rotierend inkubiert. Nach Zentrifugation bei 6.000 g und Abnahme des Überstandes wird der Vorgang ein zweites Mal wiederholt. Die beiden Eluate werden vereinigt.

Die zuvor abgenommenen Inputs (1 % der Chromatinmenge der IPs) werden parallel behandelt, indem Elutionspuffer zugegeben wird. Um enthaltenes Protein und RNA zu verdauen, werden 52 µl Reversionspuffer zugegeben. Der Verdau erfolgt für drei Stunden bei 55 °C, gefolgt von acht bis zwölf Stunden bei 65 °C. Danach wird die DNA über ein Kit nach Angaben des Herstellers aufgereinigt.

Die DNA, die bei dem Aufreinigungsverfahren gewonnen wurde, wird für den Einsatz in der qPCR in einer Verdünnung von 1:6 bis 1:12 eingesetzt. Von dieser Verdünnung werden 6 µl pro Messung in Triplikaten in eine 96-Well-Platte vorgelegt. Die Bestimmung der DNA-Mengen und die Berechnung der Anreicherungen von Proteinen erfolgt wie im Kapitel 3.2.6 beschrieben.