Das System. 1zz6 [14] ist die 2.0Å Röntgenkristallographiestruktur des Apoenzyms2 (S)-2-Hydroxypropylphosphonsäureepoxidase (HppE). HppE wird zusammen mit dem Kofaktor Fe(II) im letzten Schritt der Biosynthese des aus Bakterien gewonnenen An-tibiotikums Fosfomycin benötigt. Die Proteinstruktur besteht aus zwei Molekülketten mit jeweils 198 Aminosäuren. 32 Aminosäuren konnten nicht im Experiment lokalisiert werden und sind daher nicht Teil des Strukturmodells 1zz6. In Abbildung 3.14 ist das Protein in der Cartoondarstellung zu sehen. Die zwei Proteinketten bestehen aus je einer β-Faltblattregion und einerα-Helixregion. Diese Bereiche sind, was die Sekundärstruktur betrit, sehr exibel miteinander verbunden. In Abbildung 3.14 ist zu erkennen, wie die zwei Ketten miteinander verhakt sind.
Das Ensemble. Mit concoord wurde ein Ensemble von 1000 Strukturen generiert.
Grak 3.15 zeigt ein Teilensemble von zehn Strukturen.
2 Bei einem Apoenzym handelt es sich um ein Enzym, das zu seiner vollständigen Funktion noch einen nicht-kovalent gebundenen Kofaktor benötigt. Apoenzym und Kofaktor zusammen bilden dann das so genannte Holoenzym.
3.3 System drei: 1zz6 35
Bild 3.11: Ergebnisse des k-means-Clustering bei 5hoh für zwei bis fünf Cluster; links: das Clustering im Rotationsdistanzraum, rechts: Übertragung auf die Proteinstruktur
Bild 3.12: Ergebnisse des k-means-Clustering bei 5hoh für sechs und acht Cluster; links: das Clustering im Rotationsdistanzraum, rechts: Übertragung auf die Proteinstruktur
Bild 3.13: R-Faktor und freier R-Faktor für die einzelnen tls-Renements der Struktur 5hoh
3.3 System drei: 1zz6 37
Bild 3.14: Cartoondarstellung von 1zz6; die zwei Proteinketten sind grün und blau dargestellt
Bild 3.15: Cartoondarstellung eines concoord-Ensemles von zehn Strukturen von 1zz6; die zwei Proteinketten sind grün und blau dargestellt
Bild 3.16: Distanzmatrix der Rotationen für 1zz6
Die Analyse. Grak 3.16 zeigt die normierte Distanzmatrix der Rotationsvektoren für 1zz6. Die Symmetrie der zwei Molekülketten ist deutlich zu erkennen. Von der mit Di-stance Geometry erzeugten Punktmenge zu 1zz6 wurden die die ersten vier Dimensionen verwendet. An diesem System soll etwas genauer auf den Vergleich der ursprünglichen Proteinstruktur und abstrakter Punktmenge im Rotationsdistanzraum eingegangen wer-den. In Abbildung 3.17 sind beide Strukturen dargestellt, wobei jede Aminosäure die gleiche Farbe hat wie der ihren Rotationsvektor repräsentierende Punkt. Hier wurde kein Clustering angewendet, sondern lediglich einige besondere Bereiche eingefärbt und diese Information auf das Protein übertragen. Die kompakten Gruppen von Punkten (gelb und grau) an den Enden der länglichen Struktur (grün) repräsentieren die stabilen Falt-blattbereiche. Diese Domänen sind sowohl im Protein als auch im Rotationsdistanzraum am weitesten voneinander entfernt. In der Abbildung sind in rot und blau zwei Schleifen markiert, die auf der Proteinoberäche von diesem wegzeigen. Von solchen Strukturen ist bekannt, dass sie auf Grund der wenigen Wechselwirkungen groÿe Mobilität zeigen.
Diese Beweglichkeit ist auch im Rotationsdistanzraum erkennbar: Die roten und blauen Punkte weichen deutlich von der grünen Spur ab. Die Ergebnisse des Clusterings sind wie zuvor in den Abbildungen 3.18 und 3.19 an der von Distance Geometry erzeugten Struktur und am Protein dargestellt.
Das Renement und die Bewertung. In Grak 3.7 sind freier (rot) und gewöhnli-cher R-Faktor (schwarz) für die tls-Renements von 1zz6 aufgetragen. Die Verwendung von zwei Gruppen senkt den freien R-Faktor um ca. 2,5 Prozent und die Verwendung von vier Gruppen nochmals um 0,5 Prozent. Eine höhere Gruppenanzahl senkt zwar weiter gleichmäÿig den R-Faktor, aber der freie R-Faktor steigt. Es sollten also nicht mehr als vier Gruppen verwendet werden.
3.3 System drei: 1zz6 39
Bild 3.17: 1zz6: Vergleich der von Distance Geometry erzeugten Struktur (oben) und der Pro-teinstruktur (unten); gleiche Färbung entsprechender Bereiche
Bild 3.18: Ergebnisse des k-means-Clustering bei 1zz6 für zwei bis fünf Cluster; links: das Clustering im Rotationsdistanzraum, rechts: Übertragung auf die Proteinstruktur
3.3 System drei: 1zz6 41
Bild 3.19: Ergebnisse des k-means-Clustering bei 1zz6 für sechs und sieben Cluster; links: das Clustering im Rotationsdistanzraum, rechts: Übertragung auf die Proteinstruktur
Bild 3.20: R-Faktor und freier R-Faktor für die einzelnen tls-Renements der Struktur 1zz6
4 Diskussion
4.1 System eins: 2epe
Die biologische Funktion des Lysozyms äuÿert sich in der Proteindynamik durch eine Bie-gebewegung der N- und C-terminalen Domänen um die zentrale Bindungstasche. Diese Dynamik wurden von der Methode sehr gut erfasst, wie bei der Einteilung in zwei Grup-pen zu sehen ist. Dass diese Dynamik auch im Proteinkristall eine Rolle spielt, erklärt beim tls-Renement den deutlichen Abfall des freien R-Faktors um drei Prozent. Die Methode war hier also in der Lage groÿe Konformationsänderungen in einer Proteinkette aufzuspüren und daraus sinnvolle Gruppen für ein tls-Renement zu bestimmen. Bei der Aufteilung des Systems in sechs Gruppen ergab sich ein Abfall des freien R-Faktors und Anstieg des R-Faktors im Vergleich zur Aufteilung in fünf Gruppen. Was die genaue Ursache dieses Verhaltens ist, muss untersucht werden.
4.2 System zwei: 5hoh
Eine Betrachtung der Anordnung der vier Ketten in der Proteinstruktur lässt vermuten, dass es sinnvoll ist, jeder Proteinkette eine tls-Gruppe zuzuordnen. Das durch diese Methode ermittelte Distanzmaÿ der Rotationsvektoren deutet auch auf diese Vierteilung des Systems hin. Die Darstellung des Distanzmaÿes in Distance-Geometry-Struktur ist diese Aufteilung ebenfalls deutlich erkennbar. K-means hat sich hier bewährt und diese Gruppierung auch detektiert. Auch das tls-Renement hat gezeigt, dass die Vierteilung deutlich zur Senkung des freien und gewöhnlichen R-Faktors beiträgt. Diese Aufteilung des Proteins wäre auch ohne die neu entwickelte Methode einleuchtend gewesen. Da die Methode aber automatisch zu diesem Ergebnis gekommen ist, ohne Vorgaben in diese Richtung erhalten zu haben, bestätigt es die Verlässlichkeit der Methode.
Ein Blick auf die höheren Gruppierungen in Grak 3.12 lässt jedoch vermuten, dass es bessere Aufteilungen geben könnte. Allerdings ist bei dieser Struktur die Vierteilung die klarste Gruppierung und Einteilungen in mehr als vier Gruppen erscheinen im Vergleich dazu unmotivierter.
4.3 System drei: 1zz6
In diesem vom Standpunkt der Dynamik aus komplexeren System ist es der Me-thode gelungen, durch Verwendung von nur zwei Gruppen den freien und gewöhnlichen R-Faktor deutlich zu senken. Die Einteilung in zwei Gruppen entsprach nicht der Eintei-lung, jeder Proteinkette eine tls-Gruppe zuzuordnen, wie es bei 5hoh der Fall war. Die Methode ist also in der Lage gewesen, auch bei mehrkettigen Proteinen die Gruppierun-gen vom dynamischen und nicht strukturellen Standpunkt aus zu fällen.
concoord benutzt keine Annahmen über die Symmetrie von Proteinketten oder den Proteinen selbst. Daher ist die Symmetrie der von Distance Geometry erzeugten Struktur bei diesem System ein Zeichen, dass die 1000 concoord-Strukturen den Kongurations-raum gut abdecken.