Synthese von intrinsisch fluoreszierenden cycloSal-Pronucleotiden

Zur Darstellung von iso-dA 109a war auf eine bekannte Synthese zurückgegriffen worden.^[99] Ausgehend von dG führte diese über das 6-Thio-Derivat 119 unter anschließender Reduktion mit Nickel zur Zielverbindung 109a. Durch anschließende arton-Desoxygenierung konnte iso-ddA 109b in mäßiger Ausbeute erhalten werden.^[95]

B

NH N N

N

O OH

HO NH₂

S

dG 3 Stufen 62%

Raney-Ni 95%

N N N

N

O R

HO NH₂ 4 Stufen

35%

R = OH, iso-dA 109a

R = H, iso-ddA 109b 119

Abb. 80: Synthese von iso-dA 109a und iso-ddA 109b

Ein Problem bei dieser Reaktionsführung, ist die Verwendung von Nickel, welches als toxisches Schwermetall bereits in Spuren in Zelltests störend sein kann. Obwohl also diese Synthese vermutlich auch zur Darstellung von iso-d4A 109c geeignet wäre, wurde nach einer alternativen Route gesucht. Eine weitere Möglichkeit zur Reduktion von G-Derivaten wurde schließlich in der Chlorierung der 6-Position mit anschließender Hydrierung gefunden.^[98] Die von V. Nair et al. publizierte photochemische Reduktion konnte hingegen trotz zahlreicher Versuche unter unächst wurde Guanosin (G) an den drei OH-Gruppen mit Essigsäureanhydrid

iner deutlichen Verbesserung der Ausbeute an 21. Wie bereits erwähnt, versagte die photochemische Reduktion von 121 im

UV-hotoreaktor (253 nm) in Gegenwart von Triethylamin, indes führte die Reduktion verschiedensten Bedingungen nicht nachvollzogen werden.^[97]

Z

acetyliert. Das Produkt Ac3-G 120 konnte aus Toluol und iso-Propanol kristallisiert werden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von DMAP zwar beschleunigt, führte aber auch zu ca. 20% zu einer Acetylierung der exocyclischen Aminogruppe. Daher sollten in der Reaktion keine Katalysatoren verwendet werden. Die nachfolgende Chlorierung an C-6 gelang mit Tetraethylammoniumchlorid (TEAC) und POCl3 in Acetonitril.^[100] Die Trocknung von TEAC über P2O5 im Exsikkator und die Destillation von N,N-Dimethylanilin führten zu e

1 P

unter Wasserstoffatmosphäre mit einem Palladium-Kohle-Katalysator zu ervorragenden Ausbeuten an acetyliertem iso-A 122. Die Abspaltung der h

Schutzgruppen gelang in wässriger Ammoniaklösung bei quantitativem Umsatz zu iso-A 42.

O Cl

G

N N N

N

O OAc

AcO NH₂

OAc TEA

Ac₂O MeCN 88%

NH N N

N

O OAc

AcO NH₂

OAc

TEAC

N,N-Dimethylanilin POCl₃

MeCN 76%

N N N

N

O OAc

AcO NH₂

OAc N

N N N

O OH

HO NH₂

OH

H₂/Pd/C TEA, THF 92%

NH₃ H₂O 99%

120 121

42 122

einfacher.

Abb. 81: Synthese von iso-A 42

Wie in der in Abb. 80 beschriebenen Synthese war auf diese Weise (Abb. 81) also auch eine vierstufige Reaktion zur Transformation der Nucleobase notwendig, und gleichermaßen wurde eine gute Ausbeute von ca. 60% über die Stufen erreicht, allerdings musste kein Nickel verwendet werden. Außerdem erwies sich die chromatographische Aufarbeitung der Verbindungen als deutlich

Es sind verschiedene Methoden zur Einführung einer Doppelbindung an vicinalen Diolen bekannt. In dieser Arbeit wurden zwei davon hinsichtlich ihrer Eignung zur Darstellung von iso-d4A untersucht: Die Corey-Winter Olefinierung und eine Barton-McCombie analoge reduktive Didehydrogenierung.^[101] Im ersten Fall ließe sich auf eine Schützung der primären OH-Gruppe eventuell verzichten, da aber für die Durchführung der Barton-Reaktion auf jeden Fall eine 5´-Schutzgruppe benötigt wurde, sollte auch das 5´-geschützte Edukt für die Corey-Winter-Olefinierung verwendet werden, um Nebenreaktionen zu vermeiden. Zunächst wurde daher die 5´-OH-Gruppe mit TBDMS-Chlorid blockiert, um die nachfolgenden Umsetzungen vornehmen zu können.

N N N

N

iso-A 42 i)

ii) O iii)

O

TBDMSO NH₂

N N N

N

NH₂

O S

N N N

N

O O

TBDMSO NH₂

O 5´-O-TBDMS-iso-A 123

S MeS

S SMe

O RO

vi)

iv)

v)

R = TBDMS; 126 R = H; iso-d4A 109c

i) TBDMS-Cl, Pyridin, 67%; ii) Thiocarbonyl-diimidazol, DMF, 59%; iii) Triethylphosphit, 55%;

iv) CS₂, NaOH, MeI, DMSO, 86%; v) AIBN, TTMSS, Toluol, 95%; vi) TBAF, THF, 99%; vii) H₂/Pd/C, MeOH, 99%

124

125

vii)

iso-ddA 109b

bb. 82: Synthese von iso-d4A 109c und iso-ddA 109b ausgehend von iso-A 42

MAP die

Reaktion zur Unterdrückung von Nebenreaktionen eventuell

A

Die Corey-Winter Olefinierung verläuft über den oberen Reaktionsweg (ii, iii). Die Synthese des Reaktionsintermediats 124 wurde durch Zugabe von Thiocarbonyldiimidazol in DMF zu 123 erreicht, allerdings nur in unbefriedigenden Ausbeuten um 60%. Es wurde nicht mehr untersucht, ob eine Zugabe von D

Reaktion verbessert hätte, allerdings scheint eine Steigerung der Ausbeute aufgrund der Einfachheit der Umsetzung wahrscheinlich. Dies verdeutlicht aber, dass eine direkte Umsetzung von 42 ohne Schutzgruppe vermutlich nicht besonders ratsam ist.

Verbindung 124 wurde nun mehrere Stunden in Triethylphosphit als Lösungsmittel und Reagenz bei erhöhter Temperatur gerührt. Dabei kommt es wahrscheinlich zur Entstehung eines Carbens an der Thiocarbonylgruppe und schließlich zur Cycloreversion unter CO2-Entwicklung.^[102] Die Ausbeute war mit 55% als mäßig anzusehen, aber auch hier scheint noch Spielraum zur Verbesserung vorhanden zu sein, da Edukt 124 und Produkt 126 exakt den gleichen Rf-Wert aufwiesen und somit ein früherer Abbruch der

möglich gewesen wäre. Über beide Schritte verlief die Umsetzung von 123 zu 126 mit einer Gesamtausbeute von 32%. Da aber iso-A bereits in einer vierstufigen Synthese dargestellt werden musste, ist dieses Ergebnis als unzulänglich zu bezeichnen. Eine deutliche Verbesserung der Gesamtausbeute wurde über den unteren Reaktionsweg erreicht. Für die Einführung der Doppelbindung wurde Verbindung 125 benötigt, welche durch Umsetzung von 123 mit Kohlenstoffdisulfid und Natronlauge in DMSO und anschließender Methylierung mit Methyliodid in 86%iger Ausbeute erhalten werden konnte. Die nachfolgende reduktive Olefinierung zu 126 verläuft über einen Radikalkettenmechanismus. AIBN wurde als Radikalstarter und Tris-trimethylsilylsilan (TTMSS) zum Erhalt der Kettenreaktion zugegeben. Dabei stellt TTMSS eine sehr gute Alternative zu den sonst üblicherweise verwendeten toxischen Zinnorganylen dar. Es wurde ebenso versucht, die Reaktion ohne TTMSS durchzuführen, allerdings konnte in diesem Fall kein Umsatz beobachtet werden. Die Reaktion lieferte das Produkt 126 in einer hervorragenden Ausbeute von 95%. Über beide Schritte konnte unter Anwendung der Barton-Reaktion eine Gesamtausbeute von 82% erzielt werden; gegenüber der Corey-Winter Olefinierung also eine deutliche Verbesserung. Die Entschützung von 26 wurde durch Einwirkung von TBAF in THF unter quantitativem Umsatz erreicht.

ber acht Stufen argestellt werden. Gleichzeitig konnte iso-ddA 109b aus iso-d4A 109c durch 1

Ausgehend von G konnte iso-d4A 109c in 33%iger Ausbeute ü d

Hydrierung erhalten werden. Damit konnte die Ausbeute der Synthese, verglichen mit der in Abb. 80 gezeigten, um zehn Prozentpunkte verbessert werden.

Ausgehend von dem nachfolgend gezeigten carbocylischen Nucleosid 127, welches wir als Industriespende in großen Mengen besaßen, sollten nun auch fluoreszierende carbocyclische Verbindungen synthetisiert werden.

N N N

NH₃Cl N

HO

Cl

127

Abb. 83: Carbocyclisches Nucleosid-Analogon 127

Carbocyclische Nucleoside sind solche, bei denen das Sauerstoffatom des Zuckerderivates durch eine Methylengruppe ersetzt ist. Warum es im Einzelnen sinnvoll sein kann, carbocyclische Strukturen zu untersuchen und welche Vorteile sie bieten, soll hier nicht erörtert werden.^[103] Eine wichtige Eigenschaft, von der im nächsten Kapitel noch die Rede sein wird, ist die deutlich erhöhte Stabilität der glykosidischen Bindung gegenüber Säuren, da hier keine Aminal-Struktur vorliegt.

Die Verbindung 127 war auch gerade deswegen so interessant, weil aus ihr recht schnell größere Mengen fluoreszierender Nucleosidanaloga zugänglich sein sollten.

Es war in der Literatur bereits beschrieben worden, wie sich bei dem Carbocyclus 127 ohne Nebenreaktion an der Doppelbindung das Chloratom reduktiv entfernen lässt.^[104] Zunächst konnte die in der Literatur angegebene Vorschrift nur mit sehr geringen Ausbeuten nachvollzogen werden. Das änderte sich, als der für die Reaktion verwendete wässrige Ammoniak in mehreren Chargen zugegeben wurde, um das Ausgasen zu kompensieren. Zudem ist in der folgenden Abbildung die Hydrierung von 127 zu carba-iso-ddA 130 gezeigt.

N N N

NH₃Cl N

HO

Cl

127

N N N

NH₂ N

HO

R

R= H, 128, 35%

R= N Zn-Staub

konz. NH₃

H₂, 129, 27%

N N H₂/Pd/C N

TEA, THF

NH2

N HO

130 83%

Abb. 84: Reduktive Umsetzung von 127 zu carba-iso-d4A 128 und carba-iso-ddA 130

Auf diese Weise ließ sich also recht schnell eine große Menge intrinsisch fluoreszierender Nucleoside der iso-A-Reihe darstellen. Interessant war auch die Entstehung des carba-d4-2,6-Diaminonebularine 129, welches sonst aus 127 im rhalten wird.^[104] Prinzipiell sind alle diese Verbindungen als Prodrugs für entsprechende G-Derivate anzusehen, da entweder Autoklaven in Gegenwart von Ammoniak e

die 6-Aminogruppe durch Adenosindeaminase (ADA) in eine Carbonylgruppe übergeführt werden kann, oder die 2-Position durch Xanthin-Oxidase (XAO) oder Aldehydoxidase oxidiert werden kann.[32,33,104] Daher waren auch für alle Verbindungen die antiviralen Daten von Interesse.

Die Synthese der Verbindungen d4m⁵K 110c und BV-dm⁵K 113 gelang hingegen nicht. Beide Nucleoside BVdU 11 und d4T 3 konnten zwar TBDMS-geschützt werden, was nicht unbedingt weiter verwunderlich ist, und auch die Überführung beider Verbindungen in die entsprechenden Triazolide 131/115 gelang in guten Ausbeuten, bei der Umsetzung mit PTAD konnte allerdings kein definiertes Produkt isoliert werden.

BVdU 11

O TBDMSO

N N O

OTBDMS

Br N

N

N Br

O TBDMSO

N N O

OTBDMS

d4T 3

O TBDMSO

N N

O N N

N

O TBDMSO

N N

O i) 80%

ii) 80% iii)

i) 87%

ii) 92%

iii) 131

i) TBDMS-Cl, Pyridin

ii) Triazol, POCl₃, TEA, MeCN iii) Hydrazin, PTAD, Dioxan

115 133

132

5

radikalischen Mechanismus hin, der folgenderweise formuliert werden könnte:

Abb. 85: Versuch der Synthese von 132 und 133

Es stellte sich nun die Frage, warum denn die Reaktion so gut geeignet war, dm K 110a und ddm⁵K 110b darzustellen, hier andererseits vollkommen versagte. Da der Mechanismus der Reaktion nicht bekannt ist, lassen sich an dieser Stelle nur Mutmaßungen anstellen. Es ist z.B. so, dass die Reaktion mit einer besseren Ausbeute verläuft, wenn man die Lösungsmittel vorher entgast. Dies deutet auf einen

N N N

N

R

N O

R N

N O

HN NH2 NH

N

R N

N O

R N

N O H

H₂NNH₂ PTAD

N N -N2

R O

Abb. 86: Postulierter radikalischer Mechanismus zur Reduktion mit PTAD

Wenn tatsächlich unterschiedliche Radikalspezies auftreten, könnte das erklären, warum die Reaktion bei d4T 3 versagt, da hier auch die Doppelbindung reagieren ann. Bei BVdU 11 wäre prinzipiell die Bromvinyleinheit betroffen. Mit den vorhandenen Daten und verwendeten Mitteln lässt sich natürlich ein solcher Mechanismus nicht aufklären. Immerhin aber steht der postulierte Mechanismus im Einklang mit den gefundenen experimentellen Ergebnissen und gibt eine Antwort auf die Frage, warum denn so ähnliche Verbindungen wie d4m⁵K 110c und ddm⁵K 110b nicht auf demselben Wege darstellbar sind.

Es mussten nun noch die entsprechenden cycloSal-Triester aus den neuen Nucleosidanaloga gewonnen werden. Dies geschah auf teilweise unterschiedlichen Wegen. Der Grund liegt darin, dass eine neue, direkte Synthese von Phosphorchloridaten entwickelt worden war, die im nächsten Kapitel vorgestellt werden soll. An dieser Stelle sollen nur die optimalen Kupplungsbedingungen anhand der fluoreszierenden carbocyclischen Nucleoside untersucht werden. Die andere Verbindung wurde über die bereits ausführlich diskutierte Chlorphosphitmethode synthetisiert.

k

N

O P O O

N N NH₂ N

O O O P

O Cl iso-d4A 109c

1) DIPEA, DMF, MeCN 134

2) t-BuOOH 30%

111c

Abb. 87: Synthese von 3-Me-cycloSal-iso-d4AMP 111c

Die Umsetzung der carbocyclischen Nucleoside carba-iso-d4A 128 und carba-iso-ddA 130 wurde in einer Mischung aus Pyridin und THF durchgeführt. Alternativ kann für die Umsetzung statt THF auch DMF gewählt werden. Pyridin hingegen muss bei der Reaktion verwendet werden, da es gleichzeitig als Aktivator für das Phosphorchloridat wirkt. Wegen der Empfindlichkeit von Phosphorchloridaten in Gegenwart von Pyridin, muss die Reaktion bei mindestens -40 °C durchgeführt werden, was in etwa auch dem Gefrierpunkt entspricht. Daher ist der Zusatz anderer

ösungsmittel nötig.

L

N N N

NH₂ N

O

O O P O

Cl

O O P O

N N N

NH₂ N

O O O P O carba-iso-ddA 130

carba-iso-d4A 128

135

71% 136

82%

137

nur ungenau abgewogen werden. Die hosphorchloridate hingegen sind luftstabil und können durch Chromatographie gereinigt werden. Meist liegen sie als Feststoffe vor und können daher sehr genau eingewogen und problemlos über lange Zeiträume gelagert werden. Weiterhin kommt bei den Synthesen anstelle von DIPEA Pyridin als Base zum Einsatz.

yridiniumchlorid lässt sich wiederum wesentlich leichter chromatographisch these der Phosphorchloridate ist im ächsten Kapitel mit ihren Einschränkungen beschrieben, daher soll hier nicht weiter darauf eingegangen werden. Ein Nachteil der Methode ist sicherlich die etwas

Abb. 88: Synthese der Zielverbindungen 136 und 137 mit der Phosphorchloridat-Methode

Diese Methode lieferte für die ersten Versuche ausgesprochen gute Ausbeuten (136:

71%; 137: 82%). Damit empfiehlt sie sich als echte Alternative zur Chlorphosphitmethode, mit welcher sie nun kurz verglichen werden soll: Ein wesentliches Problem bei der P(III)-Route ist die genaue Dosierung des Chlorphosphits, gerade bei kleinen Ansätzen. Sie liegen oft als Öle vor und können wegen ihrer Luftempfindlichkeit

P

P

abtrennen, als DIPEA-Hydrochlorid. Die Syn n

mühselige Durchführung, da die Reaktionstemperatur über 6 h bei -40 °C gehalten werden muss. Dies kann allerdings durch die Verwendung eines Cryostaten erreicht werden.

Um genauere Aussagen über das Verhalten „lock-in“-modifizierter cycloSal-Pronucleotide treffen zu können, sollten solche Triester mit intrinsisch fluoreszierenden Nucleosidanaloga dargestellt werden. Die Synthese des Aminosäurester-modifizierten Chlorphosphits 106 wurde im letzten Kapitel in Abb. 61

ereits beschrieben. In diesem Fall war ein Phenylalanin-Ester verwendet worden, da die Hoffnung bestand, die Löslichkeit in Diethylether könnte gegenüber Alanin-Estern verbessert sein. Leider wurde diese Hoffnung enttäuscht, und so musste die Reaktion in THF unter Inkaufnahme der üblichen Verunreinigungen durchgeführt werden. Die Synthese von POM-funktionalisierten Chlorphosphiten ist bereits beschrieben worden. An dieser Stelle soll aber kurz die Einführung von AM-Acylalen diskutiert werden. Der Grund für die Einführung dieser Modifikation wird auf den nächsten Seiten genannt.

b

O O O O

O O O

OH OH OH

O O

O O

Ph OH

OH

O O

68a

i) Benzaldehyddimethylacetal, p-TsOH, THF; ii) AM-Br, DIPEA, THF, 56%; iii) kat. HCl, Reflux, 1min, 82%;

iv) PCl3, Pyridin, Et2O, 65%

i) ii)

iii)

138 139

O O

O O

iv)

P Cl 140

Abb. 89: Synthese des AM-modifizierten Chlorphosphits 140

Die Synthese des Salicylalkohols 68a ist bereits im letzten Kapitel beschrieben worden. Ganz analog der POM-Funktionalisierung konnte die AM-Modifikation eingeführt werden, zunächst durch Schützung des Salicylalkoholes mit Benzaldehyddimethylacetal, dann durch Umsetzung mit kommerziell erhältlichem Acetoxymethylbromid (AM-Br). Da das Bromid reaktiv genug war, musste zuvor keine Finkelsteinreaktion durchgeführt werden. Auf diese Weise gelang die Synthese der Verbindung 138 in 56%iger Ausbeute. Da für die nachfolgenden Reaktionen genug von der Verbindung vorhanden war, wurde keine Reaktionsoptimierung durchgeführt. Die Entschützung von 138 zum Salicylalkohol 139 gelang durch kurzes

Aufkochen der Verbindung in einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser, dem drei Tropfen konzentrierter Salzsäure zugesetzt waren. Diese Methode liefert bei einer Vielzahl verschiedener Salicylalkohole stets hervorragende Ausbeuten. In diesem all konnte der Salicylalkohol 139 trotz der Acylalmodifikation in 82%iger Ausbeute

weniger unter Standardbedingungen abliefen, ist in der lgenden Abbildung jeweils nur die Ausbeute angegeben, in welcher die einzelnen Triester erhalten wurden.

F

nach Chromatographie isoliert werden. Die Umsetzung zum Chlorphosphit konnte in Diethylether mit PCl3 durchgeführt werden. Pyridin diente als Base und konnte nach beendeter Reaktion als Pyridiniumchlorid durch Schlenkfiltration entfernt werden. Die geringe Ausbeute von 65% legt in diesem Fall Verluste bei der Schlenkfiltration nahe.

Dennoch konnte genug des Chlorphosphits 140 für die weiteren Synthesen erhalten werden. Ein entsprechendes Phosphorchloridat wurde nicht synthetisiert, da zu diesem Zeitpunkt die Methode noch nicht bekannt war.

Die Synthese der „lock-in“ modifizierten, intrinsisch fluoreszierenden cycloSal-Triester wurde in DMF/THF- oder DMF/Acetonitril-Gemischen durchgeführt. Als Base diente DIPEA, zur Oxidation wurde tert-Butylhydroperoxid verwendet. Da die Synthesen alle mehr oder

fo

O

O P O

O O

O O

O

O O

N N O

OH P

O O O

Bn O Bn

OBn

O N

N N

NH₂ N

O O

112f; 24%

112g; 14%

111e; 21%

P O O O N OBn

H O

O O

N N O NH

OH

Abb. 90: Intrinsisch fluoreszierende, „lock-in“-modifizierte cycloSal-Triester

Die relativ niedrigen Ausbeuten sind verschiedenen Faktoren zuzuschreiben; da wegen der fortgeschrittenen Anzahl der Syntheseschritte nur geringe Mengen der Edukte zur Verfügung standen, war eine genaue Dosierung der Reagenzien äußerst schwierig. Letztendlich handelt es sich natürlich auch um recht komplexe Verbindungen, bei denen Nebenreaktionen vermehrt auftreten könnten. Insgesamt aber reichten die dargestellten Mengen für die angestrebten Untersuchungen aus.

Zusammen mit den bereits in meiner Diplomarbeit synthetisierten Verbindungen soll nun im nächsten Kapitel das analytische Potential erschlossen werden.

5.4.2 Charakterisierung der intrinsisch fluoreszierenden

Im Dokument Untersuchungen zur intrazellulären Freisetzung von Nucleosidphosphaten (Seite 109-119)