cycloSal-Pronucleotiden
4.1.2 Acylale zur „lock-in“-Modifikation
4.1.2.3 Charakterisierung der 3-Methyl-5-POM-funktionalisierten cycloSal- cycloSal-Pronucleotide
cycloSal-Triester 74 in 36% Ausbeute erhalten werden. Die Schutzgruppe wurde mit 10%
Trifluoressigsäure in Ethanol entfernt. Erneute Chromatographie lieferte die Zielverbindung 58 in quantitativer Ausbeute.
ACVDMTr 73 59
O O O
O O
O
P O
NH N N
O
NHDMTr N
O O i)
ii)
O O O
O O
O
P O
NH N N
O
NH2
N O O
74
58 i) DMF, DIPEA, t-BuOOH
ii) TFA/EtOH 1:10 v/v, 30 min
100%
36%
Abb. 32: Synthese der Zielverbindung 58
Auf diese Weise konnten alle Zielverbindungen 56-58 in Ausbeuten von 61%, 35%
und 36% dargestellt werden. Komplexe POM-funktionalisierte Verbindungen können folglich zur Maskierung von unterschiedlichen Nucleosidanaloga verwendet werden.
4.1.2.3 Charakterisierung der 3-Methyl-5-POM-funktionalisierten
ONucl O
O O
O O
O
P O
Od4T O
O O
OH
P O Nucl = d4T 53b, dm5K 75, ddm5K 76
ONucl O
O P O
Nucl = d4T 77, BVdU 78, ACV 79
Od4T O
O P O 49
80
O HO
N N
O
R
R= OH; dm5K 81 R= H; ddm5K 82
Abb. 33: Referenzverbindungen
Die chemischen Hydrolysehalbwertszeiten t1/2 (pH = 7.3) der Zielverbindungen 56-58 sowie 49, 53b und 75-80 wurden nach einem standardisierten Verfahren ermittelt (s.
Experimentalteil), wobei die zeitliche Abnahme der Konzentration des jeweiligen Triesters bestimmt wird. Für die Verbindungen 56-58 wurde bei der Aufnahme von HPL-Chromatogrammen TBAH-Ionenpufferlösung verwendet, um den Mechanismus der Hydrolyse detaillierter aufklären zu können. Zunächst sollen die ermittelten Werte für die Halbwertszeiten t1/2 in einem Säulendiagramm verglichen werden.
0 5 10 15 20 25
80 77 78 79 53b 75 76 49 56 57 58
t (1/2) [h]
3-Me-5-POM 5-POM 5-COOH
3-Me 5-Me
Diagramm 1: Vergleich der chemischen Stabilität in PBS pH= 7.3
Es soll nun ein Phänomen diskutiert werden, das bislang für alle
cycloSal-bb. 34: Postulierter assistierender Effekt bei der Hydrolyse von cycloSal-Pronucleotiden
eiterhin fällt durch Vergleich der Halbwertszeiten von 80 und 77 auf, dass eine Pronucleotide gefunden wurde: die Verminderung der Stabilität bei Anwesenheit einer 3´-OH-Gruppe. So hydrolysiert z.B. der 3-Methyl-cycloSal-Triester von BVdUMP 78 gegenüber dem 3-Methyl-cycloSal-Triester von d4TMP 77 unter Freisetzung von BVdUMP um den Faktor zwei schneller. Das gleiche Verhalten ist für den „lock-in“-modifizierten Phosphattriester von dm5KMP 75 gegenüber dem
„lock-in“-modifizierten Triester von ddm5KMP 76 zu erkennen. Beide Verbindungen unterscheiden sich lediglich in der An- bzw. Abwesenheit einer 3´-OH-Gruppe. Aus diesen Daten kann folgender Schluss gezogen werden: Die 3´-OH-Gruppe von Pyrimidin-Nucleosiden beschleunigt die chemische Hydrolyse um etwa das Doppelte.
Mechanistisch kann dieses Verhalten durch einen assistierenden Effekt bei der Hydrolyse erklärt werden.
O O O
Base P
O O O X
H O H A
W
Methylgruppe in 5-Position des cycloSal-Ringsystems weniger stabilisierend wirkt, als eine Methylgruppe in 3-Position. Dies war letztlich auch der Grund dafür, bei der Synthese der Zielverbindungen 56-58 die Methylgruppe in 3-Position zu platzieren.
Weiterhin erkennt man, dass der 3-Methyl-cycloSal-Triester 79 des Purin-Nucleosids ACV gegenüber den Triestern der Pyrimidin-Nucleoside eine deutlich erhöhte Halbwertszeit hat. Auch dies ist ein genereller Trend, der bei vielen anderen Purin-Nucleosiden bestätigt wurde. Bislang wurde davon ausgegangen, dass dieses Verhalten auf die Hydrathülle der Moleküle zurückgeführt werden kann. Es gibt inzwischen Hinweise, dass sich die Unterschiede auf verschiedene konformative Eigenschaften zurückführen lassen. Dies soll im Folgenden nur kurz diskutiert werden, da wirklich verlässliche Daten noch nicht vorhanden sind. CycloSal-Triester liegen als Diastereomeren- oder Enantiomerengemische vor. In manchen Fällen lassen sich diese Gemische trennen, man erhält die Diastereomere mit definierter Konfiguration am Phosphoratom. Die Kristallisation eines solchen Diastereomers
zeigte eine π-stacking-Wechselwirkung des cycloSal-Rings mit dem Pyrimidin der Nucleobase T.[82] Da das andere Diastereomer nicht kristallisierte, ist nicht bekannt, ob diese Wechselwirkung auch hier vorliegt. Zudem ist bekannt, dass die Halbwertszeit der chemischen Hydrolyse für die einzelnen Diastereomere unterschiedlich ist und zwar um ca. den Faktor 2 (s.S. 65). Weiterhin treten bei cycloSal-Triestern von intrinsisch fluoreszierenden Pyrimidin-Nucleosiden erhebliche Quenching-Effekte in Lösung bei der Fluoreszenzemission auf, nicht aber bei intrinsisch fluoreszierenden Purin-Nucleosiden (s. S. 103). Die Annahme soll nun sein, dass die chemische Hydrolyse von cycloSal-Pronucleotiden dann beschleunigt ist, wenn eine konformative Fixierung durch eine π-π-Wechselwirkung der aromatischen Systeme vorliegt.
Es ist in Diagramm 1 außerdem zu erkennen, dass die Säure 49 ebenfalls eine
verifiziert werden.
deutlich erhöhte Halbwertszeit aufweist. Dies scheint erneut ein genereller Trend zu sein, der für andere Triester mit freier Säurefunktion bestätigt wurde (s.S. 65, Diagramm 4). Da diese Säuren bei pH= 7.3 deprotoniert vorliegen, könnte eine repulsive Wechselwirkung mit Hydroxidionen die verlangsamte Hydrolyse erklären.
Es sollen nun die Eigenschaften der Zielverbindungen diskutiert werden. Besonders der ACV-Triester 58 zeigt eine hohe chemische Stabilität (t1/2= 21 h). Er ist sogar noch stabiler, als 3-Methyl-cycloSalACVMP 79 (t1/2= 18 h). Eigentlich überrascht dieses Verhalten nicht, da zusätzlich zur 3-Methylgruppe durch die Modifikation in der 5-Position des Aromaten die Elektronendichte im System erhöht wird, wodurch die Phenylphosphatesterbindung stabilisiert wird. Dieses Verhalten ist bereits bei 3,5-Dimethyl-substituierten cycloSal-Triestern beobachtet worden. Für die beiden Zielverbindungen 56 und 57 kann eine Erhöhung von t1/2 gegenüber den 5-POM-funktionalisierten Referenzverbindungen 53b und 75 ohne 3-Methylgruppe festgestellt werden. Sie liegt aber für 56 (t1/2= 7 h) bei weitem nicht in dem Bereich von 3-Methyl-cycloSal-d4TMP 77 (t1/2= 14 h) und erreicht auch für 57 lediglich den Wert von etwa 6 h, welcher ebenso für den 3-Methyl-BVdU-Triester 78 gefunden wurde. Aus diesen Daten wird ersichtlich, dass eventuell noch ein weiterer Faktor die Hydrolyse der Verbindungen beeinflusst, der bei steigender chemischer Stabilität der Phenylphosphatesterbindung zunehmend ins Gewicht fällt. Die folgende Abbildung gibt einen Überblick über die möglicherweise stattfindenden Abbaumechanismen.
Anschließend soll der postulierte Mechanismus mit den HPL-Chromatogrammen
P O O O O
O
O O
O tBu
ONucl Nucl= d4T 56
BVdU 57 ACV 58
P O O O O
OH
ONucl OH
OH
NuclMP
P O O O
O OH
ONucl
- HCHO
Nucl= d4T 83a BVdU 84a ACV 85a
Nucl= d4T 83b BVdU 84b ACV 85b Nucl= d4T 83c
BVdU 84c ACV 85c
Weg a
Weg b Weg c a
b c
Abb. 35: Postulierte Hydrolysemechanismen für 56-58
direkte Hydrolyse des Triesters durch ine SNP-Reaktion unter Freisetzung der NMP 83c-85c. Diese folgt dem Für die Triester 56-58 beschreibt Weg a die
e
Standardmechanismus, welcher für cycloSal-Pronucleotide umfassend untersucht wurde (s. Kenntnisstand S. 14). Eine weitere Möglichkeit besteht in der Spaltung der POM-Gruppe durch Hydrolyse einer der Estergruppen. Dabei führt Weg b direkt zu den freien Säuren 83b-85b. Die anschließende Hydrolyse liefert erneut die Monophosphate 83c-85c. Bei Weg c erfolgt die Spaltung der POM-Funktion unter Freisetzung der instabilen Intermediate 83a-85a, welche in Formaldehyd und die freien Säuren 83b-85b zerfallen. Sowohl bei Weg b, als auch bei Weg c sollten als Hydrolyseintermediate die freien Säuren 83b-85b auftreten. Da diese generell höhere Halbwertzeiten t1/2 bei pH 7.3 besitzen, als die korrespondierenden Triester 56-58, sollten sie in den HPL-Chromatogrammen nachweisbar sein. Weil die freien Säuren 83b-85b im Syntheseverlauf nicht erhalten wurden, wurden sie gezielt durch Inkubation der Triester 56-58 mit Schweineleber-Esterase (PLE) als Referenzverbindungen dargestellt. Im Folgenden ist ein Chromatogramm des ACV-Triesters 58 nach 80 min Inkubation mit 0.9 U PLE bei pH= 7.3 unter Ionenpaarbedingungen (TBAH-Ionenpuffer) dargestellt.
5 10 15 20 2
O O
5
58
tR= 15.33 min 85b
tR= 10.85 min
t [min]
Abb. 36: Bestimmung der Retentionszeit von 85b (Methode 2) durch Inkubation von 58 mit PLE
uf diese Weise konnten die in den Chromatogrammen der chemischen Hydrolyse
b
an erkennt deutlich, dass bei erhöhter chemischer Stabilität der
P O O
A
auftretenden Peaks den „lock-in“-Triestern 56-58, den freien Säuren 83b-85b und den NMP 83c-85c zugeordnet werden. Dies sei im Folgenden am Beispiel des BVdU-Triesters 57 diskutiert.
A b. 37: Chemische Hydrolyse von 57 bei pH= 7.3 (Methode 3)
M
Phenylphosphatesterbindung nun auch eine Spaltung des Acylals über Weg b und c zu 84b stattfindet, so dass insgesamt die Stabilität nicht in dem Maße erhöht ist, wie ohne eine Spaltung des Acylals zu erwarten wäre. Da die chemische Stabilität für den ACV-Triester 58 deutlich höher liegt, als für vergleichbare Pyrimidin-Nucleoside, sollte hier die Spaltung des Acylals noch signifikanter ausfallen. Dies konnte mit den Chromatogrammen der chemischen Hydrolyse bewiesen werden.
O OH
P O O O OACV
O O
O
OACV
O O
P O O O
5 10 15 20 25
3 h
25 h 0 h
84b BVdUMP
84c
57
t [min]
O O
OBVdU
O
P O OO OH
OBVdU
Abb. 38: Chemische Hydrolyse von 58 bei pH= 7.3 zu 85b und ACVMP 85c (Methode 2)
O
Am Beispiel des d4T-Triesters 56 soll ein weiteres Phänomen bei der Hydrolyse von ycloSal-Triestern diskutiert werden, welches bereits auf S. 17, Abb. 14 vorgestellt c
wurde. Es handelt sich dabei um die Umsetzung des Triesters in PBS-Puffer mit Phosphationen in Konkurrenz zur Reaktion mit Hydroxidionen. Auf diese Weise wird neben d4TMP 83c auch d4TDP 83d freigesetzt.
O O
N HN
O
O O
O O
O O
O
P O
H2PO4 56
O O
N HN
O
O O
O P O P O O
O
83d - Maske
Abb. 39: Zersetzung von 56 zu d4TDP 83d
Hydrolyse vom d4T-Triester 56 erkennt man ach sehr langer Inkubationsdauer (77 h) die Endprodukte der Reaktion. Unter Im Chromatogramm der chemischen
n
Annahme gleicher Absorptionskoeffizienten der Verbindungen lässt sich eine Aussage über die freigesetzten Mengen an d4TMP 83c und d4TDP 83d ausgehend von dem d4T-Triester 56 treffen. Es zeigt sich, dass etwa 88% d4TMP und 12%
d4TDP entstehen. Zudem lässt sich ableiten, dass die intermediär auftretende Säure 83b tatsächlich weiter zu d4TMP 83c hydrolysiert.
5 10 15
ACVMP 85c 85b
58
20 h 0 h
t [min]
P O OO
O O
O
OACV O
P O OO OH
OACV 85b
4 6 8 10 12 14 16
d4TMP 83c
83b
56
d4TDP 83d
77 h 0 h
t [min]
Abb. 40: Endprodukte der chemischen Hydrolyse von 56 (Methode 3)
ie tatsächliche Bildung von d4TDP 83d wurde nicht durch Coinjektion bewiesen, D
kann aber durch Verfolgung der chemischen Hydrolyse mittels 31 P-NMR-Spektroskopie bewiesen werden. Dazu wurden die Verbindungen in 0.35 mL 50 mM PBS (pH= 7.3) und 0.35 mL DMSO-d6 gelöst und in Abständen von Tagen und Wochen 31P-NMR-spektroskopisch analysiert. Die folgende Abbildung zeigt die Ergebnisse des Experimentes mit 56.
Puffer
d4TMP
ppm (t1) 0.0 -5.0 -10.0
X
d4TDP
Abb. 41: 31P-NMR-spektroskopische Verfolgung der Hydrolyse von 56 (Endpunkt)
uch hier erkennt man die Freisetzung von d4TDP. Die Integration ergab eine
Metabolit X
A
Menge von etwa 14%, also eine gute Übereinstimmung mit den durch HPL-Chromatographie erhaltenen Werten. Bei Metabolit X könnte es sich um geringe Mengen der Säure 83b handeln, die nur sehr langsam weiter hydrolysiert.
Mit den vorgestellten Experimenten lässt sich ein detailliertes Bild des chemischen
achdem der chemische Hydrolysemechanismus nun hinreichend aufgeklärt wurde,
0-, bzw.
Hydrolysemechanismus von POM-funktionalisierten cycloSal-Pronucleotiden zeichnen, welches im Wesentlichen in Abb. 35 wiedergegeben ist und das nur um die Freisetzung von d4TDP 83d aus den einzelnen Triestern ergänzt werden müsste. Es bleibt allerdings ungeklärt, ob die Hydrolyse des POM-Acylals über Weg b oder Weg c abläuft. Da bei beiden Möglichkeiten allerdings ohnehin die Säuren 83b-85b entstehen, wurden keine weiteren Mühen zur Aufklärung unternommen. Es könnte aber die Hydrolyse in 18O angereichertem Wasser und nachfolgende massenspektrometrische Analyse der Lösung ein abschließendes Ergebnis liefern.
N
soll im Folgenden auf das Verhalten der Pronucleotide 56-58 in biologischen Medien eingegangen werden. Da bereits gezeigt wurde, dass AM- und POC-Acylale in dem RPMI-FCS-Kulturmedium an Stabilität einbüßen, POM-Acylale hingegen weitgehend stabil sind, wurde für die neuen POM-funktionalisierten Pronucleotide mit Methylgruppe in 3-Position ein ähnliches Verhalten angenommen. Daher wurden Hydrolysestudien in RPMI-FCS nicht durchgeführt. Die Stabilität der Verbindungen soll im nächsten Abschnitt vielmehr aus der TK--Aktivität abgeleitet werden.
Die Stabilität der Verbindungen 56 und 57 wurde zunächst in humanen CEM/
P3HR1-Zellextrakten untersucht (Durchführung s. Experimentalteil). Für das d4T-Prodrug 56 wurde CEM/0-Extrakt verwendet, da dies der Zelltyp war, in dem auch die antiviralen Daten in vitro ermittelt wurden. P3HR1-Extrakt wurde aus gleichem Grund für das BVdU-Prodrug 57 verwendet. Im nachfolgenden Säulendiagramm sollen die Halbwertszeiten der enzymatischen Hydrolyse einiger Verbindungen verglichen werden.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
56 57 53b 80 78
t (1/2) [h]
Diagramm 2: Vergleich der enzymatischen Stabilität
Da 5-Methyl-cycloSal-d4TMP 80 keine enzymatisch spaltbaren Gruppen besitzt, bleibt auch die Stabilität im Vergleich zur chemischen Hydrolyse konstant. 5-(POM-prop)cycloSal-d4TMP 53b verliert hingegen dramatisch an Stabilität (t1/2(PBS)= 5 h vs t1/2(CEM/0)= 0.4 h). Der direkte Vergleich mit dem d4T-Triester 56 zeigt, dass die Methylgruppe in 3-Position keinen Einfluss auf diese rasche enzymatische Hydrolyse nimmt (t1/2(PBS)= 7 h vs t1/2(CEM/0)= 0.5 h). Für den BVdU-Triester 57 wurde sogar nur eine enzymatische Halbwertszeit von 10 min in P3HR1-Extrakt ermittelt, gegenüber der Referenzverbindung 3-Me-cycloSal-BVdUMP 78 mit t1/2= 8 h. Diese Ergebnisse zeigen, dass die „lock-in“-modifizierten Triester 56 57 und 53b tellen. Die folgende Abbildung zeigt die
b
us den in Abb. 42 gezeigten Ch
rführung von 57 in die Säure 84b durch enzymatische Spaltung des POM-Acylals ervor. Weiterhin erkennt man die Polaritätszunahme, die mit dieser Spaltung inhergeht. Für das d4T-Derivat 56 und das ACV-Derivat 58 wurde exakt das leiche Verhalten gefunden, weswegen die Chromatogramme hier nicht mehr bgebildet werden sollen. Von synthetischem Interesse zur Darstellung der freien
äuren ist die Inkubation mit PLE in wässrigem Medium. Für das ACV-Derivat 58 urde nach 150 min Inkubation mit 4 U PLE eine vollständige Transformation zur
wurde allerdings verzichtet.
, hervorragende Substrate für Esterasen dars
HPL-chromatographische Analyse der enzymatischen Hydrolyse des BVdU-Triesters 57 nach verschiedenen Inkubationsdauern.
5 10 15
84b
57
60 min 15 min 0 min
t [min]
P O O O O
O O
O
OBVdU P
O O O O
OH
OBVdU
A b. 42: Hydrolyse von 57 in P3HR1 (Methode 3)
A romatogrammen geht deutlich die selektive
Übe h e g a S w
Säure 85b festgestellt. Auf eine Isolierung
4 6 8 10 12 14 16
85b 58
t [min]
P O OO O
O O
O
P OACV O O O O
OH
OACV
Abb. 43: Synthese von 85b aus 58 durch enzymatische Hydrolyse mit PLE
Bislang erfüllten die dargestellten „lock-in“-Pronucleotide 56-58 die an si Anforderungen. Dazu zählen eine erhöhte chemische Stabilität im Vergleic
e gestellten 53b und eine rasche Spaltung der POM-Modifi
vorkommende Esterasen. Es blieb daher letztendlich nur noch zu klären, ob eine beschleunigte Spaltung in humanem Blutserum auftr
herauszufinden, wurde der BVdU-Triester 57 exemplarisch in 10% humanem Serum bei pH= 6.8 inkubiert (Für Details s. Experimentalteil). Die ermittelte Halbwertszeit unter diesen Bedingungen lag für 57 bei ca. 8 h, also leicht erhöht gegenüber t 2 bei pH= 7.3 (t1/2= 7 h). Das kann darauf zurückgeführt werden, dass bei erniedrigtem
pH-sich insgesamt keine nzymatische Spaltung der POM-Gruppe in humanem Serum ableiten lässt.
h mit kation durch vermehrt intrazellulär
eten würde. Um dies
1/
Wert die chemische Hydrolyse langsamer abläuft, so dass e
Nachfolgend sollen noch einmal die ermittelten Hydrolysewege zur Freisetzung der Nucleosidmonophosphate in unterschiedlichen Medien dargestellt werden. Die gestrichelten Pfeile deuten eine nur geringe Zersetzung auf dem entsprechenden Weg an, die durchgängigen Pfeile stehen für die hauptsächliche Umwandlung.
P O O O O
O O
O tBu
pH 7.3 O
ONucl N
ucl= d4T 56 BVdU 57 ACV 58
P O O O O
OH
ONucl NuclMP
P O O O
O OH
ONucl
- HCHO
Nucl= d4T 83a BVdU 84a ACV 85a
Nucl= d4T 83b BVdU 84b ACV 85b Nucl= d4T 83c
BVdU 84c ACV 85c
pH 7.3 Serum
Serum
Zellextrakt
pH 7.3 Serum
pH 7.3 Serum Zellextrakt Zellextrakt
Abb. 44: Zusammenfassung der Freisetzung von Nucleosidmonophosphaten aus 56-58
s konnten also mit der 3-Methyl-5-POM-cycloSal-Maskierung alle an das System onzept auf ndere Nucleoside mit verschiedenen funktionellen Gruppen und deutlich
Dr. Astrid kum Jena, wurden die antiviralen Eigenschaften vitro ermittelt. Da bis zum jetzigen Zeitpunkt die anti-EBV- und anti-HSV-Daten für E
gestellten Anforderungen erfüllt werden. Außerdem wurde das „lock-in“-K a
unterschiedlicher Struktur erweitert. Im folgenden Abschnitt sollen nun die antiviralen Eigenschaften der Verbindungen diskutiert werden.
4.1.2.4 Antivirale Eigenschaften der 3-Methyl-5-POM-funktionalisierten