cycloSal-Pronucleotiden
4.1.2 Acylale zur „lock-in“-Modifikation
4.1.2.4 Antivirale Eigenschaften der 3-Methyl-5-POM-funktionalisierten cycloSal-Pronucleotide
P O O O O
O O
O tBu
pH 7.3 O
ONucl N
ucl= d4T 56 BVdU 57 ACV 58
P O O O O
OH
ONucl NuclMP
P O O O
O OH
ONucl
- HCHO
Nucl= d4T 83a BVdU 84a ACV 85a
Nucl= d4T 83b BVdU 84b ACV 85b Nucl= d4T 83c
BVdU 84c ACV 85c
pH 7.3 Serum
Serum
Zellextrakt
pH 7.3 Serum
pH 7.3 Serum Zellextrakt Zellextrakt
Abb. 44: Zusammenfassung der Freisetzung von Nucleosidmonophosphaten aus 56-58
s konnten also mit der 3-Methyl-5-POM-cycloSal-Maskierung alle an das System onzept auf ndere Nucleoside mit verschiedenen funktionellen Gruppen und deutlich
Dr. Astrid kum Jena, wurden die antiviralen Eigenschaften vitro ermittelt. Da bis zum jetzigen Zeitpunkt die anti-EBV- und anti-HSV-Daten für E
gestellten Anforderungen erfüllt werden. Außerdem wurde das „lock-in“-K a
unterschiedlicher Struktur erweitert. Im folgenden Abschnitt sollen nun die antiviralen Eigenschaften der Verbindungen diskutiert werden.
4.1.2.4 Antivirale Eigenschaften der 3-Methyl-5-POM-funktionalisierten
penetriert oder nur äußerst schlecht das NMP freisetzt, z.B. aufgrund einer zu hohen Halbwertszeit. Wenn man davon ausgeht, dass die Freisetzung von d4TMP effektiv verläuft, verbleibt nur eine verminderte Membranpermeabilität. In einem solchen Fall hydrolysiert das Pronucleotid außerhalb der Zelle und setzt dort d4TMP frei. Da dieses auch nicht in der Lage ist, über die Zellmembran zu gelangen, sollte auch keine antivirale Wirkung in TK+-Zellen auftreten. Da diese Aktivität aber oftmals gefunden wurde, muss davon ausgegangen werden, dass Phosphatasen in dem Kulturmedium d4TMP zu d4T dephosphorylieren, welches dann wiederum in die Zelle gelangen kann und zum d4TTP anabolisiert wird. Solche Prozesse erklären daher die Wirksamkeit von Pronucleotiden, auch wenn keine Aktivität in TK-defizienten Zellen vorliegt.
Als weitere Anmerkung sei vorweggeschickt, dass die Ergebnisse für d4T 3 aus der Testreihe stammen, die zusammen mit Prodrug 56 ermittelt wurde. Daher ist ein quantitativer Vergleich mit 53b und 49 nicht möglich. Man kann aber qualitative
50
Feststellungen z.B. in Bezug auf die TK--Aktivität treffen.
EC50a [μM] CC b [ μM]
CEM/0 CEM/TK- CEM/0
Verbindung HIV-1 HIV-2 HIV-2
3-Me-5-(POM-prop) 56 0.65 ± 0.07 0.70 ± 0.21 12.5 ± 3.5 54.6 ± 6.2 5-(POM-prop) 53b 0.23 ± 0.04 0.33 ± 0.11 0.70 ± 0.08 23.8 ± 4.0 Säure 49 0.14 ± 0.10 0.80 ± 0.20 50.0 ± 30.0 73.6 ± 0.0 d4T 3 0.70 ± 0.14 0.50 ± 0.14 58.3 ± 38.2 > 250
a50% effektive Konzentration z ng ati oxisch ion
rale Profile von 56 53 3
end mit einer eringeren Cytotoxizität. Die Aktivität in CEM/0 entspricht hingegen der von d4T 3.
ur Unterdrücku der Virusreplik on; b50% cytot e Konzentrat Tab. 2: Antivi und der Referenzverbindungen b, 49 und d4T
Trotz der geringen strukturellen Veränderung von 56 im Vergleich zu 53b wurde ein fast vollständiger Verlust der TK--Aktivität gemessen, einhergeh
g
Obwohl die Testergebnisse oft erheblichen Schwankungen unterliegen, ist dieses Ergebnis doch eindeutig: Das Pronucleotid 56 passiert entweder die Zellmembran nicht effektiv oder die freie Säure 83b weist eine zu große chemische Stabilität auf,
was zu einer nur sehr langsamen Freisetzung von d4TMP führt. Eine weitere Ursache könnte in der geringen Wasserlöslichkeit von 56 liegen, die gegenüber der von 53b nochmals verringert ist. Dies wird durch die reduzierte Cytotoxizität angedeutet. Alle Faktoren zusammengenommen könnten den deutlichen Verlust an TK--Aktivität erklären. Die hohe Aktivität in CEM/0 müsste dann aus der vergleichsweise schnellen chemischen Hydrolyse von 56 (gegenüber 83b) im Kulturmedium zu d4TMP und den nachfolgend bereits erläuterten Prozessen stammen. In diesem Zusammenhang wären insbesondere die Daten des ACV-Derivates 58 interessant, welches eine bessere Wasserlöslichkeit aufwies.
Abschließend zu diesem Thema bleibt zu sagen, dass es trotz deutlicher Erhöhung der chemischen Stabilität von POM-funktionalisierten cycloSal-Pronucleotiden unter rhalt der intrazellulären enzymatischen Spaltung nicht zu einer Verbesserung der
ystem entwickelt werden, elches weder toxische Substanzen wie Pivalinsäure freisetzt, noch im
Abschnitt 4.1.1 wurde das Konzept der Estermodifikation bereits diskutiert. Dabei on bei einem C2-Spacer nicht tattfindet und auch eine Verlängerung des Linkers um zwei weitere E
antiviralen Daten gekommen ist. Zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit könnten die AM-Acylale zwar synthetisiert werden, wegen der verminderten Stabilität im Kulturmedium scheinen hier eher keine Fortschritte erzielbar zu sein. Der vorangegangene Satz wirft allerdings ein grelles Licht auf die Frage, ob es überhaupt sinnvoll ist, Verbindungen auf ihre Stabilität in in vitro Testsystemen zu optimieren, da sie am Ende mit der Realität wenig gemein haben.
Um die Probleme zu umgehen, die im Zusammenhang mit Acylal-funktionalisierten Pronucleotiden auftraten, sollte ein neues „lock-in“-S
w
Kulturmedium gespalten wird. Zudem sollten die Verbindungen eine höhere Wasserlöslichkeit aufweisen, als z.B. der Triester 56. Als ein erfreulich flexibles System zur Umgehung der oben beschriebenen Probleme hat sich die Modifikation des cycloSal-Systems mit Aminosäurestern herausgestellt. Dies soll im folgenden Abschnitt beschrieben werden.
4.1.3 Aminosäureester zur „lock-in“-Modifikation In
hatte sich gezeigt, dass eine Spaltung der Esterfunkti s
Methylengruppen nur in Leberextrakten zu dem gewünschten Ergebnis führte.
Allerdings bewirkt das Einfügen weiterer Methylengruppen in den Spacer eine deutliche Zunahme der Lipophilie und mithin eine Abnahme der Wasserlöslichkeit.
Eine Verlängerung des Linkers ist hingegen sehr einfach denkbar durch Peptidkupplung der Säuregruppe des C2-Spacers mit einem Aminosäureester. Dies führt zu der in der folgenden Abbildung gezeigten Leitstruktur, die in ihrem Aufbau höchst flexibel ist.
P O O O O
N X H
O Y O
ONucl
Abb. 45: Neuartige „lock-in“-modifizierte cycloSal-Pronucleotide
Bei diesem System lassen sich verschiedene Ester Y einführen und auf ihre Eignung dem können unterschiedliche minosäuren (X) mit verschiedener Stereochemie untersucht werden. Durch die
untersucht wurden. Hierzu zählen die Phosphoramidat-Nucleotide als Substrate für Carboxyesterasen untersuchen. Zu
A
flexible Einführung von Aminosäuren lässt sich auch die Wasserlöslichkeit beeinflussen.
An dieser Stelle sei erwähnt, dass Pronucleotidsysteme unter Verwendung von Aminosäuren und Aminosäurestern bereits von anderen Arbeitsgruppen teils mit großem Erfolg
(Aminosäureester am Phosphoratom) von C. McGuigan et. al., die zur intrazellulären Freisetzung von NMP geeignet sind[45], aber auch einfache Aminosäuremodifikationen von Nucleosiden zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit.
Als Beispiel sei hier das Valaciclovir 86 genannt, ein Wirkstoff, der in der klinischen Therapie von HSV und VZV angewendet wird.[83]
NH N N
O
NH2
N O O
O H2N
86
Abb. 46: Valaciclovir (VACV)
Die Modifikation mit L-Valin führt zu einer durch den Peptidtransporter hPEPT1 vermittelten Aufnahme im großen Intestinum. Nachfolgende enzymatische Hydrolyse liefert ACV 7.[84] Durch diesen Mechanismus ist die Bioverfügbarkeit von ACV erhöht, so dass deutlich geringere Mengen VACV verabreicht werden müssen.
ässt man einmal die prinzipielle Möglichkeit einer rezeptorvermittelten Aufnahme L
von Aminosäureestern außer acht, die bislang ohnehin nur für Ester mit freier Aminogruppe gefunden wurde, so ergeben sich für den intrazellulären Einschluss von cycloSal-Triestern, welche auf diese Weise modifiziert wurden, verschiedene hydrolytische Mechanismen, die zur Freisetzung verschiedener Intermediate führen.
Allen Intermediaten ist gemein, dass sie gegenüber der Startverbindung eine erhöhte Polarität besitzen und zudem in der Lage sein sollten, das entsprechende NMP freizusetzen. Die folgende Abbildung gibt einen Überblick über die potentiellen Demaskierungsreaktionen am Beispiel von d4T 3.
Lock-in
Modifikation Weg 1
P O O O O
NH
O R
O
O O
N HN
O
O R
Weg 2
Weg 3
Weg 4 d4T
P O O O O
NH
O O
Od4T R
Enzymatisch
Enzymatisch
P O O O O
O
Od4T
49
P O O O
Od4T Hydrolyse
Hydrolyse
Abb. 47: Potentielle Hydrolysemechanismen für cycloSal-Pronucleotide mit Aminosäure-Ester-Modifikation
Weg 1 gibt die enzymatische Hydrolyse zur Säure 49 durch z.B. eine Peptidase wieder. Eine pH-abhängige Hydrolyse scheint wegen der großen Stabilität der Peptidbindung unwahrscheinlich. Das geladene Intermediat kann dann durch
83c
chemische Hydrolyse d4TMP 83c freisetzen. Weg 2 beschreibt die enzymatische Hydrolyse durch eine Esterase, welche zum geladenen Peptid als Intermediat führt.
usgehend von diesem Intermediat könnte durch eine Peptidase erneut die Säure 49
zum intrazellulären Einschluss befähigte Maske zu erhalten, ollte das neue System zunächst an d4T 3 als Referenznucleosid untersucht werden.
e Strukturen.
A
entstehen (Weg 4) oder, durch direkte chemische Hydrolyse, d4TMP 83c. Weiterhin sollte die langsame chemische Hydrolyse direkt d4TMP 83c freisetzen (Weg 3). Es galt nun zu untersuchen, auf welchem Weg die Hydrolyse stattfindet, ob durch schnelle enzymatische Reaktion ein effektiver intrazellulärer Einschluss erreicht werden kann und ob die Cytotoxizität solcher Verbindungen gegenüber den POM-Acylalen vorteilhaft ist. Dazu jedoch mussten zunächst die Verbindungen synthetisiert werden.