Synthese und Evaluation von siRNA mit Glucose-Derivaten

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Tabelle 5.1 Zusammenfassung der Anandamid-siRNAs mit unterschiedlicher Zucker-Modifizierung zur Regulation der Renilla-Luciferase. Kleine Buchstaben bezeichnen dabei RNA-Oligonukleotide, während große Buchstaben DNA-Oligonukleotide kennzeichnen. X = 2’Fluoro-Oktadiinyl-Uridin.

Duplex

(sense/antisense) Sequenz (sense/antisense) Struktur AEA-Luc-siRNA

(ORN1+4/ORN2)

5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cX(+4)T 3’-TTccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g

AEA-Glc- Luc-siRNA

(ORN1+4/

ORN2+42)

5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cX(+4)T 3’-TX(+42)ccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g

AEA-TriGlc- Luc-siRNA

(ORN1+4/

ORN2+37)

5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cX(+4)T 3’-TX(+37)ccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g

AEA-Cyclo- Luc-siRNA

(ORN1+4/

ORN2+38)

5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cX(+4)T 3’-TX(+38)ccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g

Glc-Luc-siRNA

(ORN1/ORN2+42) 5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cX(+42)T 3’-TTccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g

AEA-Cyclo-Tri- Luc-siRNA ((ORN1)3+1/

(ORN2)3+38)

+1 5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cXT 3’-TXccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g +38

AEA-Glc-Tri- Luc-siRNA ((ORN1)3+1/

(ORN2)3+42)

+1 5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cXT 3’-TXccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g +42

Die Protein-Regulationen durch sämtliche in Tabelle 5.1 aufgeführten Anandamid-Glucose-siRNAs ist in Abbildung 5.6 dargestellt. Zunächst konnte die von Julian Willibald beschriebene Steigerung der Regulation durch Anandamid-siRNA durch eine Glucose-Modifizierung reproduziert werden. Durch Einführung des Glucose-Triazids wurde eine weitere, wenn auch nur sehr geringe Steigerung erzielt. Dies könnte über den Glycocluster-Effekt^[161] und somit

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durch eine bessere Wechselwirkung mit Zucker bindenen Proteinen auf der Zelloberfläche erklärt werden.

Interessanterweise führt die Modifizierung des antisense-Strangs mit einem Cyclodextrin analog zur Glucose-Modifizierung ebenfalls zu einer gesteigerten Protein-Regulation in Relation zu Anandamid-siRNA. Auch eingesetzt wurde die trimere siRNA-Struktur mit drei Cyclodextrin bzw. Glucose antisense-Strängen. Mit diesen komplexen Strukturen wurden die besten Protein-Regulationen innerhalb dieses Experiments erreicht. Somit konnten die in dieser Arbeit entwickelten trimeren Strukturen erneut als sehr effektiv für die Regulation von Proteinen herausgestellt werden.

Abbildung 5.6 Luciferase-Assay mit unterschiedlichen Anandamid-Zuckerderivat-siRNA-Strukturen (Tabelle 5.1). Die Experimente wurden in RBL-2H3-Zellen durchgeführt.

Wurde eine siRNA mit ausschließlich einer Glucose-Modifizierung eingesetzt, so konnte überraschenderweise ebenfalls eine Regulation der Renilla-Luciferase gemessen werden (Abbildung 5.6). Glucose ist daher auch ohne die Anwesenheit von Anandamid in der Lage einen Transport in das Cyctoplasma von RBL-2H3-Zellen zu bewirken. Gleichzeitig ist es nun naheliegend, dass die von Julian Willibald beobachtete gesteigerte Protein-Regulation durch Glucose modifizierte Anandamid-siRNA, durch einen zusätzlichen Aufnahmeweg mittels Glucose bindender Proteine begründet werden kann.

Dies sollte abschließend durch eine Konzentrationsreihe genauer untersucht werden. Dabei wurde der Anandamid-Duplex (AEA-Luc-siRNA) sowie die Glucose-siRNA

(Glc-Luc-65

siRNA) in drei Konzentrationen (125, 250, 500 nM) eingesetzt. Zusätzlich wurde die Glucose-siRNA auf Zellen, inkubiert mit Glucose freiem Medium, gegeben. Gewöhliche Zellmedien besitzen eine Konzentration von 11 mM an freier Glucose. Freie Glucose sowie die Glucose gebunden an siRNA stehen somit im Wettbewerb, in der Bindung an einen Glucose-Transporter oder Rezeptor. Durch den Einsatz eines Glucose freiem Mediums sollte daher einer gesteigerte Proteinregulation erreicht werden.

Abbildung 5.7 Luciferase-Assay mit Anandamid (AEA-Luc-siRNA) sowie Glucose (Glc-Luc-siRNA) modifizierter siRNA in RBL-2H3-Zellen. Die Glucose-siRNA wurde dabei auch auf Zellen inkubiert mit glucosefreiem ((-)-Glc) gegeben.

In Abbildung 5.7 sind die Ergebnisse dieses Luciferase-Assays dargestellt. Im Fall der Anandamid- oder Glucose-siRNA wurde stets ein konzentrationsabhängiger Effekt erreicht.

Dabei führte die Anandamid-siRNA stets zu einer geringfügig höheren Protein-Regulation als die Glucose-siRNA. Diese wurde auch auf Zellen, inkubiert mit Glucose freiem Medium, gegeben. Dadurch konnte im Vergleich zur Glucose-siRNA in Glucose haltigem Medium eine Steigerung der Proteinregulation erzielt werden. Somit scheint freie Glucose im Medium die Aufnahme der Glucose-siRNA zu beinträchtigen. Dies ist ein starker Hinweis, dass die Anwesenheit von Glucose zu einer Hemmung der Aufnahme der Glucose-siRNA führt und diese somit aktiv durch ein Glucose bindendes Protein in die Zelle transportiert wird.

Dies wurde in Kooperation mit der Gruppe von Prof. Bräuchle bestätigt, wobei nicht nur eine Aufnahme in RBL-2H3-Zellen sondern auch eine Aufnahme in HeLa-Zellen detektiert wurde.

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Dabei konnte die Aufnahme der Glucose-siRNA durch ansteigende Konzentration an freier Glucose im Medium gehemmt werden. Gleichzeitig konnte durch einen GFP markierten Glucose Transporter 1 sowie durch eine Fluorophor markierte Glucose-siRNA deren Interaktion herausgestellt werden. Dies wurde durch Colokalisation des Fluorophors sowie der GFP-Markierung gezeigt. Zusammenfassend konnte deutlich demonstriert werden, dass Glucose einen aktiven Transport von siRNA in Zellen vermitteln kann.

Soll in späteren Experimenten die Spezifität von Anandamid-siRNA in vivo gezeigt werden, muss die hier beschriebene Glucose vemittelte Aufnahme berücksichtigt werden. In derartigen Experimenten ist es daher nicht sinnvoll eine siRNA sowohl mit Glucose als auch mit Anandamid zu modifizieren, da beide Moleküle in der Lage sind eine Aufnahme in Zellen zu bewirken. Das in diesem Kapitel beschriebene Cyclodextrin zur Modifizierung von siRNA stellt eine artifizielle Struktur dar, welche keine Membranpermeabilität besitzt.^[5] Gleichzeitig wurde jedoch durch diese Modifizierung die gleiche Steigerung der Protein-Regulation analog zu Glucose beobachtet. Daher ist für derartige in vivo Experimente eine Modifizierung mit dem hier vorgestellten Cyclodextrinmonazid sinnvoller.

6 Folsäure vermittelter Transport von siRNA

Fast man die bisher gewonnen Ergebnisse zusammen, so konnte durch Entwicklung einer trimeren siRNA-Struktur und Zucker-Modifizierungen eine gesteigerte Protein-Regulation erreicht werden. Diese Konzepte sollten nun auch auf ein anderes Liganden-System nämlich das Folat-System übertragen werden. Durch dieses System wurde bisher insbesondere ein Transport von Chemotheapeutika in Krebszellen beschrieben.^[4]