Anandamid vermittelter Transport im Vergleich zu jetPRIME

Zu Beginn sollte die breite Anwendbarkeit des Anandamid-siRNA-Systems untermauert werden. Dazu wurde zunächst die Effizienz der Anandamid vermittelten Aufnahme mit der Effizienz, erzielt durch ein kommerziell verfügbares kationisches Transfektionsreagenz, (jetPRIME) verglichen. Wie in Kapitel 1.5.1 beschrieben bilden kationische Reagenzien so genannte Lipo- oder Polyplexe mit negativ geladener siRNA aus und führen zu einer Aufnahme mittels Endozytose. Als Maß für die Transporteigenschaften wurde die Regulation einer Renilla-Luciferase verwendet, was durch den im vorherigen Kapitel beschrieben Assay quantifiziert werden kann. Durch einen ebenfalls Luciferase basierten Assay wurden außerdem die toxischen Eigenschaften der jetPRIME sowie Anandamid vermittelten Aufnahme bestimmt.

Beide Experimente sollen im Folgenden beschrieben werden und wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Conzelmann durchgeführt.

3.2.1 Regulation einer Renilla-Luciferase in humanen Immunzellen

Bisherige Experimente mit Anandamid-siRNA wurden stets in RBL-2H3-Zellen also Ratten-Mastzellen durchgeführt. Es sollte nun untersucht werden, ob Anandamid eine Aufnahme in einer humanen Immunzell-Linie (BJAB) vermitteln kann und die Transport-Effizienz mit dem kommerziell verfügbaren Transfektions-Reagenz jetPRIME verglichen werden. Dies sollte durch den im vorherigen Kapitel beschriebenen Luciferase-Assay erfolgen. Synthetisiert wurden dafür zwei gegen die Renilla-Luciferase gerichtete siRNAs mit sowie ohne Anandamid-Modifizierung (Tabelle 3.1).

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Tabelle 3.1 Zusammenfassung der synthetisierten Anandamid-siRNAs zur Regulation der Renilla-Lucifease in humanen Immunzellen (BJAB). Kleine Buchstaben bezeichnen dabei RNA-Oligonukleotide, während große Buchstaben DNA-Oligonukleotide kennzeichnen. X = 2’Fluoro-Oktadiinyl-Uridin.

Duplex

(sense/antisense) Sequenz (sense/antisense) Struktur Luc-siRNA

(ORN1/ORN2)

5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cXT 3’-TTccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g

AEA-Luc-siRNA1 (ORN1+4/ORN2)

5’-ggc-cuu-uca-cua-cuc-cua-cX(+4)T 3’-TTccg-gaa-agu-gau-gag-gau-g

In einem ersten Experiment wurde der AEA-Duplex in drei unterschiedlichen Konzentrationen, sowohl mit als auch ohne Transfektionsreagenz auf das Zellmedium gegeben und nach 48 h die Expression der Renilla-Luciferase bestimmt. Wie in Abbildung 3.5A erkennbar, wurde in beiden Fällen eine Dosis abhängige Regulation des Reporter-Enzyms erreicht. Anandamid ist somit in der Lage einen effizienten siRNA-Transport in BJAB-Zellen zu vermitteln. Dabei stellte sich heraus, dass bei einer Duplex-Konzentration von 1 μM in beiden Fälle vergleichbare Regulationseffekte erzielt werden konnten. So wurde die Renilla-Luciferase in der Anwesenheit von jetPRIME um 50 % sowie ohne jetPRIME um 40 % reguliert.

Zusätzlich wurde der Einfluss des Anandamid-Liganden in der Anwesenheit von Transfektionsreagenz untersucht. Dazu wurde ein Duplex mit, sowie ein Duplex ohne Anandamid-Ligand jetPRIME-vermittelt in die Zellen transfiziert. Wie in Abbildung 3.5B erkennbar erhöht der Ligand in Anwesenheit von jetPRIME die Protein-Regulation um einen Faktor 2. Somit scheint der Anandamid-Ligand auch in Kombination mit dem kationischen Reagenz einen dirigierenden Effekt in die Zelle zu erfüllen. Wie außerdem erkennbar, führt der mit jetPRIME transfizierte siRNA-Duplex ohne Anandamid zu einer geringeren Regulation als Anandamid modifizierte siRNA.

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Abbildung 3.5 Luciferase-Assay in einer humanen Immunzelllinie (BJAB). A) Die AEA-siRNA wurde mit sowie ohne Transfektionsreagenz in die Zellen transfiziert. B) Es wurde der Einfluss des AEA-Liganden in der Anwesenheit von jetPRIME untersucht. Dazu wurde Anandamid sowie unmodifizierte siRNA durch jetPRIME in die Zellen transfiziert.

Zusammenfassend ist Anandamid in der Lage einen effizienten siRNA-Transport vergleichbar mit kommerziellen Transfektionsreagenzien in humane Immunzellen (BJAB) zu vermitteln.

Durch kationischen Transfektionsreagenzien ist jedoch keine zellspezifische Aufnahme möglich. Durch einen ebenfalls Luciferase basierten Assay sollte im nächsten Schritt die toxischen Eigenschaften der Anandamid sowie jetPRIME vermittelten Aufnahme verglichen werden.

3.2.2 Untersuchung der Toxizität von Anandamid-siRNA

Für potentielle in vivo Anwendungen der Anandamid-siRNA musste auch untersucht werden, ob die Anandamid vermittelte Aufnahme mit toxischen Effekten für Zellen verbunden ist. Dazu wurde ein ebenfalls Luciferase basierter Assay von Promega gewählt, welcher in Kooperation mit Konstantin Sparrer (Arbeitsgruppe Prof. Conzelmann) durchgeführt wurde. Grundlage für diesen Assay ist ein Luciferin-Peptid Konjugat, welches einfach auf das Zellmedium gegeben werden kann (Abbildung 3.6). Dieses Konjugat kann die Zellmembran intakter Zellen nicht passieren. Gleichzeitig führen tote Zellen zu einer Freisetzung von Proteasen, wodurch das

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Konjugat gespalten und natives Luciferin freigesetzt wird. Dieses führt in der Anwesenheit von Luciferase sowie entsprechenden Kofaktoren zur Freisetzung von Lumineszenz, welche somit ein direktes Maß zur Quantifizierung von toten Zellen darstellt. Auch für dieses Experiment wurde die humane B-Zelllinie BJAB verwendet.

Abbildung 3.6 Luciferase basierter Assay zur Untersuchung der Toxiziät (Promega). Ein Luciferin-Peptid Konjugat kann durch Proteasen, freigesetzt von toten Zellen, gespalten werden. Das dabei freigesetzte Luciferase-Substrat kann durch ATP abhängige Decarboxylierung unter der Emission von Licht quantifiziert werden. Die Lumineszenz ist somit ein direktes Maß für Proteasen, welche von toten Zellen freigesetzt werden und kann somit zur Quantifizierung von Toxizitäten verwendet werden.

Um die Größenordnung der Lumineszenz-Werte einordnen zu können, wurden zunächst zwei Kontrollexperimente durchgeführt. Zu Beginn wurde dazu die Lumineszenz im Fall von unbehandelten Zellen gemessen. Der erhaltene Lumineszenz-Wert wurde auf eins normalisiert, so dass alle gemessenen Lumineszenz-Werte auf dieses Kontroll-Experiment bezogen werden (Abbildung 3.7).

Abbildung 3.7 Untersuchung der Toxizität von Anandamid modifizierter siRNA durch einen Luciferase basierten Assay (Konstantin Sparrer, AK Prof. Conzelmann). Anandamid-siRNA führt im betrachteten Konzentrationsintervall zu keinem Anstieg der Toxizität. Mock behandelte Zellen wurden nicht mit siRNA transfiziert. Bei der positiv Kontrolle wurden die Zellen mit überproportional viel Transfektionsreagenz inkubiert.

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Im zweiten Kontrollexperiment wurden die Zellen durch Zugabe von überproportional viel Transfektionsreagenz Stress ausgesetzt. Dabei ist bereits im Vergleich zu nicht behandelten Zellen ein deutlicher Anstieg der Luminszenz erkennbar. Zusätzlich wurden drei unterschiedliche Anandamid-Duplex-Konzentrationen mit sowie ohne Transfektionsreagenz zugegeben. Im Fall der Anandamid vermittelten Aufnahme kam es im betrachteten Konzentrations-Intervall zu keinem Anstieg der gemessen Lumineszenzen. Somit konnte in Bezug auf unbehandelte Zellen keine Toxizität von Anandamid-siRNA gemessen werden. Im Fall der Transfektionreagenz vermittelten Aufnahme stieg der Toxizitätswert bei einer Duplexkonzetration von 1 μM auf 1.4 an.

Zusammenfassend kann mit dem Anandamid-Duplex in der hier verwendeten humanen B-Zelllinie (BJAB) im Vergleich zu unbehandelten Zellen kein Toxizitätseffekt beobachtet werden. Gleichzeitig können, wie in Kapitel 3.2.1 beschrieben, mit dem Liganden-Konjugat ähnliche Regulationen, wie durch das Transfektions-Reagenz erreicht werden.