Struktur und funktionale Domänen der NFI-Proteine

NFI-Proteine bestehen aus einer N-terminalen DNA-Bindungs- und Dimerisierungsdomäne und einer C-terminalen Transkriptionsaktivierungs- oder Repressionsdomäne (siehe Abb. 2)

3.4.1 N-terminale DNA-Bindungs/Dimerisierungsdomäne

Die Bindungsdomäne der NFI-Proteine in Säugetieren ist stark konserviert und vermittelt Bindung an DNA, Dimerisierung des Transkriptionsfaktors und die Stimulation der adenoviralen DNA-Replikation (Mermod et al., 1989; Gounari et al., 1990). Eine unspezifische Bindung an doppelsträngige DNA wird durch den stark basischen N-terminalen Bereich der NFI-Bindungsdomäne (Meisterenst et al., 1989) ermöglicht, der sich vermutlich in eine alpha-helikale Struktur faltet.

Nach Fusion dieser Unterdomäne mit dem C-terminalen Bereich der Bindungsdomäne kann die DNA-Bindungsaffinität bis zu 100-fach ansteigen (Dekker et al., 1996). Der C-terminale Bereich der NFI-Bindungsdomäne ist daher verantwortlich für die spezifische Bindung der NFI-Proteine an die DNA.

Imagawa et al.(2000) konnten zwei nukleäre Translokationssignale für NFI-A ermitteln, die für den vollständigen Transport von NFI-A in den Kern verantwortlich sind. Die Translokationsmotive sind in der NFI-A Genstruktur N-terminal lokalisiert (in Exon 2 und Exon 5-6, vgl Abb. 2). Für nukleäre Translokationssignale charakteristische Sequenzabschnitte (lysin-und argininreiche Sequenzen) konnten auch in den anderen NFI-Familienmitgliedern gefunden werden. In einer Spleißvariante von NFI-A, in welcher die Exons 3-6 fehlen, wurde nur eines dieser Motive gefunden. Interessanterweise wird genau

diese NFI-A-Isoform nicht vollständig in den Kern transportiert, sondern verbleibt zum Teil im Zytoplasma.

Weiterhin befinden sich in den Bindungsdomänen aller NFI-Proteine vier konservierte Cysteinreste. Drei dieser Cysteine sind für die DNA-Bindung erforderlich (Badyopadhyay und Gronostajski, 1994), wohingegen das vierte konservierte Cystein für die oxidative Inaktivierung der NFI-Proteine verantwortlich ist (Bandyopadhyay und Gronostajski, 1994; Bandyopadhyay et al., 1998). Diese Art der Inaktivierung könnte bei der Zellantwort auf oxidativen Stress eine Rolle spielen und wurde bereits bei einigen anderen Transkriptionsfaktoren gefunden (Abate et al., 1990; Guehmann et al., 1992;

Matthews et al., 1992; Bandyopadhyay et al., 1998).

Aktivierung/Repression

c c c 4 5 6 7 8 9 10 11

Prolinreiche Region

1 210 510 As

konservierte

nukleäre Translokationssignale

Aktivierung/Repression

c c c 4 5 6 7 8 9 10 11

Prolinreiche Region

1 210 510 As

konservierte

nukleäre Translokationssignale

DNA-Bindung

1 2 c 3

α-helikale Struktur 4 konservierte Cysteinreste

DNA-Bindung

1 2 c 3

α-helikale Struktur 4 konservierte Cysteinreste

Abb. 2: Domänen der NFI-Gene in Vertebraten nach Gronostajski, 2000. Die cDNA´s aller ungespleißten NFI- Mitglieder bestehen aus 11 codierenden Exons mit einer N-terminal lokaliserten DNA-Bindungsdomäne und einer C-terminal lokalisierten Aktivierungs-oder Repressionsdomäne. In Exon 2 befinden sich für die Bindungsdomäne charakteristische Bereiche:

eine basische alpha-helikale Domäne und vier konservierte Cysteinreste. Ebenfalls konserviert sind die nukleären Translokationsdomänen der NFI-Gene. Die C-terminal lokalisierte Transaktivierungsdomäne ist unter den NFI-Genen wenig konserviert und für jedes NFI-Gen spezifisch.

3.4.2 C-terminale Aktivierungs-oder Repressionsdomäne

Die C-terminalen Regionen der NFI-Proteine sind entscheidend für die Regulation der Genexpression. Die Komplexität der Transkriptionsmodulation der

NFI-Familie lässt sich unter anderem durch das alternative Spleißen dieser Region erklären, da so eine Vielzahl verschiedener C-Termini der vier NFI-Proteine entsteht. Mermod et al. konnten 1989 zeigen, dass die letzten 100 Aminosäuren dieser außergewöhnlich prolinreichen Region für die maximale Transkriptionsaktivität eines Promotors in Drosophila erforderlich sind.

Fusioniert man diese Domäne mit verschiedenen heterologen DNA-Bindungsdomänen, so ist diese Domäne in der Lage, die Transkription in Säuger- und in Drosophila-Zellen 5- bis 10-fach zu stimulieren (Mermod et al., 1989;

Martinez et al., 1991; Seipel et al., 1992).

NFI-Proteine können die Expression von Genen nicht nur aktivieren, sondern auch reprimieren. In einigen Promotoren und Silencern konnten NFI-Bindungsstellen als „negativ“ regulatorische Elemente identifiziert werden, unter anderem im Glutathion-Transferase-P-Gen (Osada et al., 1997a) und in den GLUT 4-Genen (Cooke and Lane, 1999a). Bis jetzt ist nicht bekannt, welcher Bereich der NFI-Gene die Repression vermittelt. Zwischen den in NFI-A und NFI-X identifizierten Repressionsdomänen konnten keine Sequenzhomologien gefunden werden, so dass man von verschiedenen Mechanismen zur Repression der Genexpression durch NFI-Proteine ausgehen kann. Beruhend auf Untersuchungen, die eine Bindung von NFI-A an Silencerelemente des Glutathion-Transferase-P-Gens zeigten (Osada et al., 1997a), konnten in NFI-A zwei C-terminal lokalisierte Repressionsdomänen identifiziert werden (Osada et al., 1997b), die jeweils ungefähr 100 Aminosäuren umfassen. NFI-A bindet über diese Sequenzen möglicherweise an Silencer-Elemente in der regulatorischen Region verschiedener Gene.

Die Steuerung der Genexpression durch NFI-Proteine ist sehr komplex. Dies ist zum einen durch die Existenz von vier verschiedenen NFI-Genen einschließlich mehrerer Spleißvarianten eines jeden NFI-Gens in Vertebraten zu erklären.

Weiterhin ermöglicht die überlappende Expression der vier NFI-Proteine die Bildung einer Vielzahl von verschiedenen NFI-Homo-und Heterodimeren. Da die NFI-Proteine die Transkription an einem Promotor unter bestimmten Bedingungen aktivieren, unter anderen Bedingungen aber reprimieren können, ist es wahrscheinlich, dass die durch NFI-Proteine gesteuerte Genexpression zusätzlich zelltyp- und promotorspezifisch ist (Gronostajski, 2000).

3.4.3 Mechanismen der Aktivierung durch NFI-Proteine

Für die Aktivierung der Genexpression durch NFI-Proteine sind bisher drei Mechansimen bekannt: direkte Wechselwirkung mit allgemeinen Transkriptionsfaktoren, Interaktion mit Koaktivator-Proteinen und Bindung an Histone. Eine Isoform von NFI-C interagiert beispielsweise mit den basalen Transkriptionsfaktoren TFIIB (Kim und Roeder, 1994) und TBP (Xiao et al., 1994) in vitro und erhöht dadurch die Transkriptionsrate einiger Gene. Im C-Terminus dieses NFI-Proteins ist eine ungefähr 100 Aminosäuren lange prolinreiche Domäne lokalisiert (Mermod et al., 1989), die eine Kopie einer Heptapeptidwiederholung aus dem C-Terminus der RNA-Polymerase II enthält (Meisternst et al., 1989). Auch die Interaktion von NFI-Proteinen mit verschiedenen Koaktivator-Proteinen kann für die Modulation der Transkription entscheidend sein. In diesem Zusammenhang konnte in vitro gezeigt werden, dass die C-terminale Domäne von NFI-C an Koaktivatoren bindet und daraufhin die durch NFI-C vermittelte Aktivierung der Genexpression erfolgt (Tanese et al., 1991; Dusserre and Mermod, 1992).

Ausserdem sind NFI-Proteine in der Lage, die Transkription über Interaktionen mit Histonen zu modulieren. Dabei kommt es zu einer Verdrängung der Histone durch Wechselwirkungen der Histone mit der prolinreichen Aktivierungsdomäne der NFI-Proteine oder durch direkte Kompetition der NFI-Proteine mit den Histonen um die Bindungsstelle an der DNA. Histon H1 bindet schwach an NFI-Konsensussequenzen auf der DNA. Somit könnten NFI-Proteine möglicherweise die Transkription durch Verdrängung des Histons von NFI-Bindungsstellen aktivieren (Ristiniemi und Oikarinen, 1989; Gao et al., 1998).

3.4.4 Mechanismen der Repression durch NFI-Proteine

Auch die Repression der Genexpression durch NFI-Proteine beruht wahrscheinlich auf verschiedenen Mechanismen. Ein Möglichkeit wäre die Verdrängung anderer sequenzspezifischer Transkriptionsfaktoren durch direkte Kompetition oder durch sterische Hinderung. Am alpha1 (I) Kollagenpromotor

der Maus wird eine Kompetition zwischen NFI-Proteinen und SpI in angrenzenden DNA-Bereichen angenommen, welche die Aktivierung der Genexpression durch SpI unterdrückt (Nehls et al., 1991, 1992). Darüber hinaus wird eine direkte Repression durch NFI-Proteine als wahrscheinlich angesehen.

So reprimierten C-terminale Domänen von NFI-Proteinen nach Fusion mit heterologen DNA-Bindungsdomänen die Genexpression. Möglich wäre hier auch die Interaktion von NFI-Proteinen mit Korepressoren, wobei die verschiedenen Domänen der NFI-Proteine möglicherweise in der Lage sind, spezifische Korepressoren an die betreffenden Promotoren zu rekrutieren. Somit erhöht die zell-oder gewebstypische Expression von Koaktivatoren bzw. Korepressoren die Vielfalt der Möglichkeiten, Genexpression durch Transkriptionfaktoren der NFI-Familie zu steuern.