8 Antikörper
1.5 Restriktionsverdau von DNA
Pro 1 µg DNA wurde 1 U Enzym eingesetzt und, soweit vom Hersteller nicht anders empfohlen, bei 37°C für 1-2 h inkubiert. Für die Reaktionen wurden die vom Hersteller mitgelieferten Puffer benutzt. Bei gleichzeitigem Verdau mit mehreren Enzymen wurden die vom Hersteller vorgeschlagenen Pufferbedingungen gewählt. Bei Inkompatibilität wurde ein sequentieller Verdau durchgeführt und das Enzym durch Hitze (20 min bei 65°C) inaktiviert. Das Restriktionsprodukt wurde je nach Verwendungszweck entweder direkt eingesetzt, per PCR Purification System aufgereinigt, oder nach gelelektrophoretischer Auftrennung aus dem Gel eluiert.
1.6 Dephosphorylierung freier DNA-Enden (Sambrook et al., 1989)
Zum Entfernen freier 5´-Phosphatgruppen von linearisierter Plasmid-DNA wurde alkalische Phosphatase (shrimp alkaline Phosphatase, Roche) benutzt. Hierzu
wurden 50 ng DNA mit AP-Puffer versetzt und nach Zugabe der Phosphatase (1 U) bei 37°C inkubiert (stumpfe DNA-Enden 60 min, klebrige 10 min). Nach Zerstörung der Phosphatase (15 min, 65°C) wurde die dephosphorylierte DNA in der Ligation eingesetzt.
1.7 Ligation von DNA-Fragmenten (Sambrook et al., 1989)
Ligationen wurden entweder mittels T4-Ligase (Roche) oder mit dem Rapid DNA Ligation Kit (Roche) durchgeführt.
Zur Ligation wurden 50 ng dephosphorylierte Plasmid-DNA mit dem 5-10fachen molaren Überschuß an Insert-DNA in 30 µl Ligationspuffer mit T4-DNA-Ligase (1 U) inkubiert (2 h RT oder ü.N. 16°C).
Bei Benutzung des Rapid DNA Ligation Kits wurden Insert und Plasmid im molaren Verhältnis 3:1-10:1 eingesetzt und gemäss den Angaben des Herstellers 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Der Ligationsansatz wurde im Anschluss direkt für die bakterielle Transformation eingesetzt.
1.8 Aufreinigung von PCR-Produkten
(Concert, Rapid PCR Purification System, Life Technologies)
Alle Zentrifugationsschritte wurden in einer Eppendorf-Tischzentrifuge (1 min, 15.000 g, RT) durchgeführt. Zur Aufreinigung der PCR-Produkte wurde der Reaktionsansatz nach Zugabe von 400 µl Puffer H1 auf eine Mikrosäule pipettiert und zentrifugiert. Nach einmaligem Waschen mit Puffer H2 und anschließender Zentrifugation wurden 50 µl Tris-HCl (10 mM, pH 8, 65°C) auf die Säule gegeben, eine Minute inkubiert und die DNA durch Zentrifugation von der Säule eluiert.
Der Min elute PCR Purification Kit von Qiagen wurde für die Aufreinigung von PCR-Produkten verwendet, bei denen nach der Elution eine hochkonzentrierte DNA-Lösung vorliegen sollte (siehe ChIP-Assay). Die Aufreinigung wurde entsprechend der Herstellervorschriften vorgenommen.
1.9 Gelelektrophorese von DNA (Sambrook et al., 1989)
Zur elektrophoretischen Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden horizontale Agarosegele in 1 × TAE Puffer gefahren (SubCell. GT Elektrophoresekammern, BIO-RAD). Je nach Fragmentgrößen wurden 0,8-2%ige (w/v) Agarosegele verwendet. Die Elektrophorese wurde je nach Anwendung und Gelgröße bei 90-120 Volt durchgeführt (Laufzeiten je nach Anforderung).
Die DNA wurde mit der entsprechenden Menge DNA-Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Nach dem Ende der Elektrophorese wurden die Gele 30 Minuten in Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml in 1 × TAE Puffer) gefärbt und mit Hilfe eines Dokumentationssystems (E.A.S.Y. RH Imager, HEROLAB) im UV-Licht analysiert.
Für die Auftrennung großer DNA-Fragmente bis zu 24 kb wurde mit 0,4%igen Gelen aus Low Melting Agarose (Top Vision TM LM GQ Agarose, Fermentas GmbH) gearbeitet. Die Elektrophorese wurde in diesem Fall bei 4°C und 40-70 Volt über Nacht durchgeführt.
1.10 DNA-Isolierung aus Agarosegelen
(Concert Gel Extraction System, Life Technologies)
Alle Zentrifugationsschritte wurden in einer Eppendorf-Tischzentrifuge (1 min, 15.000 g, RT) durchgeführt. Zur Extraktion der DNA aus Agarosegelen durch Adsorption an Silicamembranen wurde die Bande unter UV-Licht ausgeschnitten, in ein Reaktionsgefäß überführt und mit dem dreifachen Volumen
Gelsolubilisierungspuffer L1 versetzt. Nach 15minütiger Inkubation bei 50°C und gelegentlichem Vortexen wurde die Lösung auf eine Concert-Säule pipettiert, zentrifugiert, einmal mit 700 µl Waschpuffer L2 gewaschen und nach Zentrifugation mit 50 µl 70°C heißem Tris-Puffer (10 mM, pH 8) eine Minute lang inkubiert und anschließend durch Zentrifugation eluiert.
Der Min elute Gel Extraction Kit von Qiagen wurde verwendet, um konzentrierte DNA-Lösungen nach der Gelaufreinigung zu erhalten. Die Extraktion erfolgte nach den Empfehlungen des Herstellers.
Die Gelaufreinigung großer DNA-Fragmente (bis 24 kb) wurde mit dem QIAEX II Gel Extraction Kit von Qiagen gemäß den Herstellerangaben ausgeführt.
1.11 DNA-Reinheitsanalyse und -Bestimmung der Konzentration
Die Reinheit und Konzentration von DNA wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers (Ultrospec 3000, Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt.
DNA-Präparationen mit einem Verhältnis A260/A280 zwischen 1,8 und 2,0 wurden für ausreichend rein befunden und für weitere Versuche eingesetzt.
1.12 DNA-Sequenzanalyse
Die Sequenzanalyse von DNA erfolgte in der Sequenzierabteilung des ZMNH.
Hierzu wurde 1 µg DNA in 7 µl ddH2O gelöst und mit 1 µl des entsprechenden Sequenzierprimers (10 pM) versetzt.
1.13 Polymerase-Kettenreaktion (Mullis et al., 1986)
Die Amplifikation von DNA wurde in 50 µl Ansätzen durchgeführt. Dazu wurden die folgenden Reagenzien auf Eis zusammenpipettiert und die DNA je nach
Anwendung entweder mit Hilfe von Taq Polymerase (Life Technologies) oder Pfu Turbo Polymerase (Stratagene) vervielfältigt.
Protokoll:
x µl DNA 50-100 ng
1 µl Primer 1 10 µM 1 µl Primer 2 10 µM
1 µl dNTPs 10 mM
5 µl PCR-/Pfu-Puffer 10x
Polymerase 0,5 U – 2,5 U
ddH2O auf 50 µl
Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte nach reaktionsspezifischen Temperaturprofilen in MJ Research PTC-200 Geräten.
Temperatur-Programm:
1.) 95°C 3 min
2.) 95°C 30 sec (Denaturierung des Doppelstranges) 3.) X°C 1 min (Annealing-Temperatur der Primer)
4.) 72°C 1 min/ 1000 Basenpaare des Templates (Extension) 5.) zurück zu Schritt 2 x entsprechende Anzahl der Zyklen 6.) 72°C 8 min (Auffüllung)
7.) 4°C (Kühlung)
Bei Verwendung von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen ™ wurde die PCR bei der niedrigeren Tm durchgeführt.
Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch analysiert und entweder per Gelelution oder mit Hilfe eines PCR-Aufreinigungskits isoliert.
1.14 Reportergen-Assay auf Luciferase-Basis
Transkriptionelle Aktivierung durch einen Transkriptionsfaktor kann man mit Hilfe eines Reporterkonstruktes messen, in dem ein Reportergen (Luciferase oder ß-Galactosidase) dem zu untersuchenden Promotor nachgeschaltet ist.
Entsprechend der Aktivierung des Promotors durch den Transkriptionsfaktor wird der Reporter exprimiert, und das Maß der Aktivierung kann nach Zusatz eines für den Reporter spezifischen Substrates ermittelt werden.
Luciferase ist ein Enzym, welches ATP-abhängig sein Substrat Luciferin umsetzt, wobei Licht abgegeben wird. Nach Kotransfektion des Luciferaseplasmids mit einem Expressionsplasmid des Transkriptionsfaktors kann am Luminometer die enzymatische Aktivität der Luciferase bestimmt werden, und damit die Aktivierung ihrer Transkription.
Für die Luciferase-Messung wurde das Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer von Promega verwendet. 48 Stunden nach Transfektion (s. 3.3.3) wurden die Zellen lysiert (s. 3.4.2). Jeweils 50 µl des Zellextraktes wurden in 96-Loch-Platten pipettiert, wobei 10 µl des Zellextraktes in verschiedenen Verdünnungen für die Proteinbestimmung (interne Kontrolle) verwendet wurden.
Die Luciferase-Messung wurde in einem Luminometer (Berthold MicroLumat Plus) durchgeführt, indem nacheinander automatisch in jede Vertiefung 100 µl Reagenz (Luciferin, ATP und MgCl2) injiziert und sofort für 15 Sekunden die Lichtemission gemessen und über die Zeit integriert wurde.
Jedes Experiment wurde als Zweifachbestimmung ausgeführt und mehrfach an verschiedenen Tagen wiederholt.
1.14.1 Proteinbestimmung (Reportergen-Assay)
Die Proteinbestimmung erfolgte parallel zu jedem Luciferase-Test und diente als Kontrolle der Transfektionseffizienz und der Zellzahl. Die gemessenen Enzymaktivitäten wurden auf den Proteingehalt normiert.
Für die Proteinbestimmung wurde der BCA-Test verwendet (siehe 2.1). 10 µl des Zellextraktes in entsprechenden Verdünnungen mit 1 x Reporterlysis-Puffer wurden mit BCA-Lösung inkubiert und die Extinktion gemessen.
1.15 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Der EMSA dient der Untersuchung von DNA-Protein-Interaktionen (Fried und Crothers, 1981). Ein radioaktiv markiertes, doppelsträngiges Oligonukleotid von
ca. 25 Basenpaaren Länge, welches eine putative Bindungssequenz enthält, wird mit seinem vermuteten Bindungsprotein inkubiert, und der Ansatz anschließend in einem nativen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Bindet das Protein an die Bindungssequenz im Oligonukleotid, so wird die Laufgeschwindigkeit des Oligonukleotids im Gel verlangsamt und es kommt zur Verschiebung („shift“) der Position der entsprechenden Bande gegenüber der des freien Oligonukleotids.
1.15.1 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden mit [32P]dCTP
Oligonukleotide wurden extern zur Synthese in Auftrag gegeben (Metabion, Invitrogen, Interactiva). Das Design der Oligonukleotide erfolgte dergestalt, dass nach „Annealing“ der einzelsträngigen Oligonukleotide jeweils am 5`-Ende ein Überhang entstand, welcher über die Klenow-Polymerase mit radioaktiv markierten Nukleotiden aufgefüllt wurde. Oligonukleotide wurden auf eine Konzentration von 100 µM in 0,1 x TE eingestellt. Je 20 µl Oligonukleotid wurden zu 60 µl TEN hinzupipettiert, 5 min auf 80°C erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Markierungs-Ansatz:
5 µl H2O
1 µl Puffer M (Roche)
0,1 µl dGTP, dTTP, dATP-Mix (je 0,33 mM)
2 µl bzw. 20 µCi [α-32P]dCTP (Amersham-Biosciences) 2 µl doppelsträngiges Oligonukleotid ( 20 µM)
1 µl Klenow-Polymerase (Roche)
Der Ansatz wurde sukzessive je 10 min bei 37°C, RT und auf Eis inkubiert. Nicht eingebaute Nukleotide wurden mittels einer Sephadex -25-Gelfiltrationssäule (Roche) durch 10minütige Zentrifugation bei 2000 g abgetrennt. Die Markierungseffizienz wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler (Beckmann) gemessen, und sollte zwischen 20000 und 1000000 cpm pro µl, gemessen nach der Cerenkov-Methode, liegen.
1.15.2 Gewinnung der DNA-bindenden Proteine
Die putativen DNA-bindenden Proteine wurden in CHO-Zellen exprimiert (siehe 3.3.1). Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion einmal mit PBS gewaschen und in 1x PBS/ 1 x Complete Protease Inhibitor (Roche) geerntet.
Nach 10minütiger Zentrifugation (4°C, 300 g) wurden die Pellets in Lysispuffer resuspendiert.
Lysispuffer (Niedrigsalzpuffer):
20 mM HEPES pH 7,8 100 mM NaCl
1 x Complete Protease Inhibitor (Roche) 5 mM DTT
Die Zellsuspension wurde 3 x in Trockeneis/Methanol eingefroren und wiederaufgetaut. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (15 min, 4°C, 15000 g) wurden die Pellets des Niedrigsalzextraktes noch einmal mit Hochsalz-Lysispuffer extrahiert.
Hochsalz-Lysispuffer wie Niedrigsalzpuffer, aber 300 mM NaCl.
1.15.3 Inkubation der Oligonukleotide mit dem Zellextrakt, Elektrophorese und Detektion
Bindungspuffer:
20 mM HEPES pH 7.8
100 mM NaCl (kein NaCl für Hochsalzextrakte) 1 x Complete Protease Inhibitor
7 mM DTT
2 mM MgCl2
Prämix:
6,5 µl Bindungspuffer 0,5 µg Cot-1 DNA (Roche) 3 µl Zellextrakt
Dieser Prämix wurde 20min bei 4°C inkubiert, anschließend erfolgte die Zugabe von 2 µl Oligonukleotid (20000 cpm).
Dieser Ansatz wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann in 1 x Beladungspuffer (5x: 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylene X, 40% Sucrose in TE) auf ein 8%iges PAA Gel aufgetragen. Als Laufpuffer diente 0.5 x TBE. Die Laufzeit der Elektrophorese betrug 3-4 Stunden bei 4°C und 720 mV.
Anschließend wurde das Gel getrocknet und die radioaktiv markierten Banden durch Autoradiographie nachgewiesen (Kodak BioMax MR).
8%iges PAA-Gel (38x30 cm):
H2O 144 ml
5 x TBE 20 ml
Acrylamid, 40% (w/v) 35 ml
TEMED 150 µl
Ammoniumpersulfat, 10% (w/v) 700 µl
1.15.4 Supershift
Der Supershift liefert Hinweise auf die Spezifität der Oligonukleotid-Protein Bindung. Zugesetzt wird ein Antikörper gegen das DNA-bindende Protein.
Dadurch wird ein weiter „Shift“ der Oligonukleotide im Gel verursacht, da sich die Masse des Oligonukleotid-Proteinkomplexes durch die Anlagerung des Antikörpers erhöht.
Der Versuchsaufbau erfolgte wie in 1.15.3 beschrieben. Zusätzlich wurde jeweils 1 µl des unverdünnten Antikörpers nach Zugabe des Oligonukleotids zugesetzt, der Ansatz wurde weitere 20min bei Raumtemperatur inkubiert, und schließlich auf das Gel aufgetragen.
1.15.5 Kompetitionsanalyse
Die Kompetitionsanalyse gibt Aufschluss über die Stärke der Oligonukleotid-Protein-Bindung. Zu diesem Zweck erfolgt die Zugabe nicht radioaktiv markierter Kompetetionsoligonukleotide im Überschuss und in ansteigenden Mengen (5-100facher molarer Überschuss). Anhand der Abnahme des Signals des markierten Oligonukleotids kann man eine Aussage über die Bindungsstärke treffen.
Der Versuchsaufbau erfolgte im Prinzip wie in 1.15.3. Die nicht radioaktiv markierten Oligonukleotide (in TE-Puffer) wurden vorgelegt, anschließend wurde das markierte Oligonukleotid zugegeben, zuletzt wurde der Prämix hinzugefügt, der Reaktionsansatz 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, und auf das Gel aufgetragen.
1.16 Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
Die ChIP-Analyse ermöglicht die Überprüfung der Bindung eines Transkriptionsfaktors an seine DNA-Erkennungssequenz in vivo. Dazu wird der Transkriptionsfaktor in eine geeignete Zelllinie transfiziert, mit einem spezifischen Antikörper präzipittiert und die an den Transkriptionsfaktor gebundene DNA mittels PCR nachgewiesen.
ChIP Assays wurden wie beschrieben durchgeführt (Shang et al., 2000). Die entsprechend transfizierten N2A- Zellen (65cm2 Petrischale) wurden 48 Stunden nach der Transfektion zweimal mit 1x PBS bei RT gewaschen und mit 1%
Formaldehyd 10 Minuten fixiert. Die Zellen wurden danach mit eiskaltem PBS gespült und mit einem Zellschaber in 100 mM Tris-HCl (pH 9.4), 10 mM DTT überführt. Der Ansatz wurde 15 Minuten bei 30 °C inkubiert und für 5 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden nacheinander mit 1 ml eiskaltem PBS, Puffer I (0.24% Triton X-100, 10 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 6.5) und Puffer II (200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES pH 6.5) gewaschen und erneut für 5 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Nach Resuspension in 0,3 ml Lysispuffer (1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 1 x Complete Protease Inhibitor (Roche)) und
Ultraschallbehandlung für 2x 10 Sekunden (UP 50H Ultraschallprozessor, Cycles
= 1, Amplitude = 70) wurde 10 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand wurde in Puffer X (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl , pH 8.1) verdünnt. Das anschließende „Immunclearing“
(2 Std, 4°C) mit 2 µg gescherter Heringssperma-DNA, 0,5 µg Anti-HA Antikörper (Roche) und Protein-A-Sepharose (45 µl einer 50 % Suspension in 10 mM Tris-HCl, pH 8.1, 1 mM EDTA) dient der Reduktion unspezifischer Signale.
Nach Abtrennung der Sepharose wurde die Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern (20 µl Anti-Myc-Antikörper von Santa Cruz) durchgeführt, dabei wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Danach wurden zum Ansatz 45 µl Protein-A-Sepharose und 2 µg Heringssperma-DNA zugegeben und es wurde für eine weitere Stunde inkubiert. Die Präzipitate wurden nacheinander mit TSE I (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl), TSE II (0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl) und Puffer III ( 0.25 mM LiCl, 1 % NP-40, 1 % Deoxycholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.1) gewaschen. Nach dreimaligem Waschen mit TE-Puffer wurden die Präzipitate dreimal mit 1 % SDS, 0.1 mM NaHCO3
extrahiert. Die Eluate wurden vereinigt und für mindestens 6 Stunden auf 65°C erhitzt, um die Vernetzung durch Formaldehyd aufzuheben. Die DNA Fragmente wurden mit dem Min elute PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Für die anschließende PCR wurden 1 µl einer 15 µl-DNA-Extraktion benutzt und 25 Zyklen für die Amplifikation eingesetzt.
2 Proteinbiochemische Methoden
2.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen mit dem BCA-Test (Smith et al., 1985)
Zur Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen wurden Reagenz A und B im Verhältnis 50:1 gemischt. Je 10 µl einer in unterschiedlichen Verdünnungen vorliegenden Proteinlösung wurden mit 200 µl dieser BCA-Lösung versetzt, gemischt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte die Vermessung der Extinktion bei 560 nm und die Ermittlung des Proteingehaltes durch Korrelation mit einer BSA-Eichreihe. Die bei einer Extinktion von 0,3- 0,4 gemessene Verdünnung wurde zur Bestimmung des Proteingehaltes herangezogen.
2.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Laemmli, 1970)
Zur Analyse von Proteinen und Proteingemischen wurden SDS-Polyacrylamidgele (Trenngel 8-12%ig, Sammelgel 5%ig, 1 mm Dicke) in Mini-
Protean III Elektrophoresekammern (BIO-RAD) verwendet. Die Proben wurden mit der entsprechenden Menge 5 × Probenpuffer versetzt, 5 min aufgekocht und kurz abzentrifugiert. Die Elektrophorese wurde mit 80 V gestartet und nach 10 Minuten auf 140 V hochgestellt. Die Laufzeit richtete sich nach den aufzutrennenden Proteingrößen. Als Molekulargewichtsstandard und zur Überprüfung des Transfers im anschließenden Western-Blot wurde die vorgefärbte BenchMark-Leiter (Life Technologies) benutzt.
2.3 Western Blot-Analyse
2.3.1 Elektrophoretischer Transfer (Towbin et al., 1979)
Nach durchgeführter Elektrophorese wurde der Transfersandwich unter Transferpuffer zusammengebaut. Es wurden Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schuell, Protran Nitrocellulose BA 85, 0,45 µm) verwendet. Zur Durchführung des elektrophoretischen Transfers bei konstanter Spannung wurde eine Mini Trans-Blot Transferzelle von BIO-RAD genutzt (120 min, 65 V, Eiskühlung oder 35 V über Nacht).
2.3.2 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen
(Ausubel, 1996)
Nach Beendigung des elektrophoretischen Transfers wurde die Membran mit der proteingebundenen Seite nach oben in eine Glasküvette gelegt. Nach kurzem Waschen mit TBS wurden 10 ml Blockierungslösung zugegeben und eine Stunde bei RT geschwenkt. Anschließend wurde der Primärantikörper in entsprechender Verdünnung für 2 h bei RT, oder über Nacht bei 4°C appliziert. Die Membran wurde dann 5 × 5 Minuten mit TBS oder PBS gewaschen und für 2 h bei RT mit dem Zweitantikörper inkubiert. Nach erneutem Waschen mit TBS oder PBS wurden die Proteinbanden mit Hilfe verstärkter Chemilumineszenz nachgewiesen.
2.3.3 Immunologischer Nachweis mittels verstärkter Chemilumineszenz (ECL)
Die Nitrozellulosemembran wurde für eine Minute mit der ECL-Detektionslösung („Super Signal West“ Pierce, 1:1-Mischung der Lösungen I und II) inkubiert. Die Lösung wurde entfernt und der Blot zwischen zwei Cellophanfolien gelegt. Die
Auswertung erfolgte durch Belichtung eines Röntgenfilms (Biomax-MR, Kodak) mit Hilfe der Membran über verschiedene Zeiträume.
2.4 Immunpräzipitation
2.4.1 Immunpräzipitation mit magnetischen Protein-A-Beads 2.4.1.1 Vorbehandlung der magnetischen Protein-A-Beads
Zunächst wurden die Protein-A-Beads 2x mit PBS (pH 7,4) gewaschen, dabei wurden pro Ansatz 80-150 µl Protein-A-Beads verwendet. Die Protein-A-Beads wurden in 200 µl PBS aufgenommen und mit dem entsprechenden Antikörper (jeweils 10 µg der L1-Antikörper pro Ansatz, 2 µg Myc-Antikörper pro Ansatz) für 30 min bei RT unter Rotation inkubiert. Anschließend wurde 3x mit PBS gewaschen.
Zur Vernetzung wurden 2 mM BS3 (Bis(sulfosuccinimidyl)suberat, Pierce) zugesetzt und der Ansatz für weitere 60 min bei RT unter Rotation inkubiert.
Nach 6-maligem Waschen mit TBS (pH 7,4) wurde 1x mit PBS gewaschen, der Ansatz in 150 µl PBS aufgenommen und gegebenenfalls bei 4°C gelagert.
2.4.1.2 Zellernte für die Immunpräzipitation
Es wurden N2A-Zellen verwendet, die in Petrischalen (65 cm2) bei Konfluenz mit entsprechenden Plasmiden transfiziert wurden, oder nur mit Transfektionsreagenzien behandelt wurden (Negativkontrolle). Pro Ansatz wurde jeweils die Hälfte der N2A-Zellen einer Petrischale verwendet. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen 2x mit PBS 2+ (0,5 mM CaCl2 und 2mM MgCl2 in 1x PBS) gespült und zur Lyse mit 1 ml Ripa-Puffer 2 (150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1x Protease Inhibitor Complete) für 30 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden abgeschabt und in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt. Vor der Immunpräzipitation wurde zum Verringern unspezifischer Bindungen mit jeweils 50 µl ungekoppelten magnetischen Protein-A-Beads bei 4°C für 1h unter Rotation inkubiert („Preclearing“). Nach
Abtrennung der Beads wurde der Überstand mit 150 µl der an Antikörper gekoppelten Protein-A-Beads versetzt und es erfolgte eine weitere Inkubation des Ansatzes bei 4°C über Nacht unter Rotation. Anschließend wurde 3x mit PBS gewaschen. Die Proben wurden mit der entsprechenden Menge 5x Probenpuffer versetzt, 5 min aufgekocht und kurz abzentrifugiert. Der Überstand wurde direkt für die Western Blot-Analyse verwendet oder bei –20°C eingefroren.
2.4.2 Proteinextraktion aus Gesamthirn für die Immunpräziptitation
Das Gesamthirn der Mäuse des entsprechenden Alters wurde mit 2 ml Homogenisierungspuffer 1 (50 mM Tris, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0,32 M Saccharose) homogenisiert. Nach einer 10minütigen Zentrifugation bei 4°C (1000 g) wurde zum Überstand 500 µl Homogenisierungspuffer 2 (1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton) zugegeben und 500 µl des Ansatzes nach dem Preclearing mit den entsprechend vorbehandelten magnetischen Protein-A-beads (2.4.1.1) versetzt und analog 2.4.1.2 verfahren.
2.4.3 Immunpräzipitation mit Protein-G-Sepharose
N2A-Zellen wurden geerntet wie unter 2.4.1.2 beschrieben. Zum Verringern unspezifischer Bindungen wurde pro Ansatz 50 µl Protein-G-Sepharose zugegeben und 1h bei 4°C geschwenkt. Für die Immunpräzipitation wurde der Überstand nach Abtrennung der Sepharose mit den entsprechenden Antikörpern versetzt und es erfolgte Inkubation des Ansatzes bei 4°C über Nacht unter Rotation inkubiert. Anschließend wurden 15 µl Protein-G-Sepharose pro Ansatz zugegeben und das Gemisch wurde für weitere 60 min bei 4°C unter Rotation inkubiert. Nun wurde 3x mit Ripa-Puffer 2 gewaschen und die Proteine mit 5x Probenpuffer eluiert. Nach Aufkochen und einem kurzen Zentrifugationsschritt wurde der Überstand für die Western Blot-Analyse verwendet.
3 Zellbiologische Methoden
3.1 Präparation und Kultivierung von primären Hippocampusneuronen Kulturen von primären Hippocampusneuronen wurden von einem bis drei Tage alten Wildtyp-Mäusen durch eine Kombination von enzymatischer und mechanischer Dissoziation erhalten (Dityatev et al., 2000). Präparation und Transfektion wurden von G.Dityateva durchgeführt.
Nach Vereinzelung wurden die hippocampalen Neuronen in einer Konzentration von ungefähr 300 Zellen pro mm2 in beschichtete Kulturschalen ausgesät. Die Schalen wurden zuvor mit Poly-L-Lysin (0,1%) und, für die entsprechenden Ansätze mit L1-Fc (10 µg/ml) oder CHL1-Fc (10 µg/ml) beschichtet. Nach 24-stündiger Inkubation in Hormon-supplementiertem Medium, welches 10%
speziell getestetes Pferdeserum enthielt, wurden die Zellen fixiert.
3.1.1 Transfektion von primären Hippocampusneuronen
Die Transfektion der Hippocampusneuronen erfolgte nach Vereinzelung der Zellen mittels der auf Elektroporation basierenden NucleofectinTM -Methode (Dityateva et al., 2003).
3.1.2 Messung des Neuritenwachstums bzw. der Neuritogenese von Hippocampusneuronen
Die Analyse des Neuritenwachstums und der Neuritogenese der u.a. mit EGFP transfizierten hippocampalen Neuronen erfolgte an einem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop (Zeiss LSM510) mit Hilfe der Software des Herstellers.
Sowohl bei der Neuritogenese als auch beim Neuritenwachstum wurden nur EGFP-positive Zellen gemessen, die keinen Kontakt zu anderen Zellen hatten.
3.2 Präparation und Kultivierung von primären Kleinhirnneuronen Kulturen von primären Kleinhirnneuronen als Einzelzellsuspension wurden von sechs bis acht Tage alten Wildtyp-Mäusen durch eine Kombination von enzymatischer (Trypsin/ DNase) und mechanischer Dissoziation erhalten (Keilhauer et al., 1985)
Die Zellen wurden resuspendiert und in serumfreiem Basal Medium Eagle (Invitrogen) kultiviert. Das Medium wurde entsprechend Chen et al. (1999), supplementiert. Die vereinzelten Neuronen wurden in einer Dichte von 5x105 Zellen pro Deckgläschen (mit 2 µg/ml immunaffinitätsaufgereinigtem L1 aus adultem Maushirn oder mit Poly-L-Lysin beschichtet) ausgesät.
Drei Stunden nach der Aussaat wurde 1 µM Inhibitor (mc-PAF, Methylcarbamyl PAF C-16, Cayman Chemical Company, USA) zugesetzt. In den Kontrollgruppen wurde kein Inhibitor zugesetzt. Nach weiteren 21 Stunden wurden die Zellen fixiert (25% Glutaraldehyd) und mit Toluidinblau (2,5% in 1% Natriumborat) gefärbt.
Die Länge der einzelnen Neuriten wurde ermittelt und quantifiziert mit einem IBAS-Bildanalysesystem (Kontron). Es wurden nur Neuriten gemessen, die keinen Kontakt zu anderen Zellen hatten und mindestens die Länge eines Zelldurchmessers besaßen.
3.2.1 Herstellung von Reaggreagaten aus Kleinhirnneuronen (Bix und Clark, 1998)
Die vereinzelten Neuronen von 3-4 Maus-Cerebella wurden in ein steriles 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und über Nacht (ohne Rotation) bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5% CO2 in 20 ml Minimum Essential Medium Eagle (SIGMA, supplementiert mit 10% Pferdeserum, 10% fötalem Rinderserum, 6mM Glucose, 200 µM Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50µg/ml Streptomycin, 10 µg/ml humanem Transferrin, 10 µg/ml Insulin, und 10 ng/ml Natriumselenit) inkubiert. Der Deckel des Falcon-Röhrchens wurde nicht fest geschlossen, um den Zellen Sauerstoffzufuhr zu ermöglichen. Diese Inkubation über Nacht ermöglicht die
Bildung von zellulären Reaggregaten (Kobayashi et al., 1995). Am nächsten Tag wurden nach leichtem Aufschütteln der Reaggregate ungefähr 4x105 Zellen pro Deckgläschen (in 12-Lochplatten) ausgesät. Die Deckgläschen wurden zuvor mit 37 µg/ml Laminin (Sigma) 2 µg/ml L1 (immunaffinitätsaufgereingt, aus adultem Maushirn), oder mit Poly-L-Lysin beschichtet.
Kurz vor dem Ausplattieren der Reaggregate wurde die Beschichtungslösung von den Deckgläschen entfernt und mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die ausplattierten Zellen wurden für eine weitere Stunde in den 37°C-Inkubator überführt, um den Reaggregaten die Adhäsion an das jeweilige Substrat zu ermöglichen. Eine Stunde nach der Ausplattierung wurde 1 µM Inhibitor (mc-PAF) in 1 ml Kulturmedium (identisch mit dem oben beschriebenen Medium, aber ohne Serum) zugegeben. In Kontrollkulturen wurde kein Inhibitor zugesetzt, aber das Medium durch serumfreies Medium ersetzt. Nach 24-stündiger Kultivierung in einem CO2-Inkubator bei 37°C wurden die Reaggregate mit 2%
Glutaraldehyd und 2% Paraformaldehyd fixiert und mit 1% Toluidinblau und 1%
Methylenblau in 1% Borax (pH 7.4) gefärbt.
Die Migration der Neuronen aus den Reaggregaten wurde mit einem IBAS-Bildanalysesystem (Kontron) untersucht.
3.2.2 Herstellung von Mikroexplantaten aus Kleinhirnneuronen
Mikroexplantate aus dem Kleinhirn der Maus wurden nach der Methode von Fischer et al. (1986) angefertigt.
Die Cerebelli wurden sechs bis acht Tage alten Wildtyp-Mäusen entnommen, in eiskaltes HBSS überführt und von Hirnhaut, Blutgefäßen und Plexus Choroideus gereinigt. Das Gewebe wurde in HBSS durch ein Sieb (Porengrösse 300µm) gepresst. Die Gewebsstücke wurden 2x in HBSS und einmal in Kulturmedium bei Raumtemperatur gewaschen. 30-40 Explantate wurden jeweils auf mit 37 µg/ml Laminin, 2 µg/ml L1 (immunaffinitätsaufgereinigt, aus adulten Maushirnen) oder Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen (16mm Durchmesser) in ungefähr 100µl Kulturmedium pro Deckgläschen ausgesät. Kurz vor dem Ausplattieren wurde die Beschichtungslösung entfernt und die Deckgläschen einmal mit HBSS gewaschen. Sechzehn Stunden nach der Aussaat wurde 1 µM Inhibitor (mc-PAF) in 1 ml Kulturmedium (identisch mit dem oben beschriebenen Medium, aber ohne
Serum) zugegeben. In Kontrollkulturen wurde kein Inhibitor zugesetzt, aber das Medium durch serumfreies Medium ersetzt. Die weitere Behandlung und Analyse erfolgte wie unter 3.2.1 für Reaggregate beschrieben.
3.3 Kultivierung von CHO- und N2A-Zellen
CHO- und N2A-Zellen wurden in 10 ml GMEM bzw. DMEM (mit entsprechender Supplementierung, s. II 5) in 75 cm2 Flaschen kultiviert. Die Kultivierungsbedingungen waren: 37°C, 5% CO2 und 90% Luftfeuchte. Die Zellen wurden bei Erreichen von Konfluenz passagiert (normalerweise nach 2-3 Tagen). Das Medium wurde entfernt und die Zellen durch 5minütige Inkubation mit 3 ml Versen abgelöst. Nach Zentrifugation (5 min, 200 g, RT) wurden die Zellen in 10 ml frischem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in einer Verdünnung von 1:5 bis 1:10 passagiert.
3.3.1 Transfektion von CHO-Zellen
(Lipofectamine Plus manual, Life Technologies)
Für die Transfektion wurden CHO-Zellen in 6-Loch-Platten (Durchmesser 35 mm, Fläche ca. 10 cm2) in 2 ml Medium kultiviert. Einen Tag vor der Transfektion wurden 2 × 105 Zellen pro 35-mm-Vertiefung ausgesät. Nach Erreichen einer Zelldichte von 80-90% wurden die Zellen einmal mit GMEM (ohne FCS und Antibiotika) gewaschen. Pro 35-mm-Vertiefung wurden 2 µg DNA transfiziert, bei gleichzeitiger Transfektion mit mehreren Plasmiden wurden jeweils 2 µg verwendet und die Mengen der Transfektionsreagenzien entsprechend erhöht. Auf 2 µg DNA kamen 6 µl Plus-Reagenz und 4 µl Lipofectamin pro Vertiefung. Nach 3-stündiger Inkubation mit dem Transfektionsansatz (1 ml) wurde die Transfektion durch Zugabe von 1 ml GMEM (10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin ) gestoppt. 24-48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet.
Bei generell größeren Transfektionsansätzen wurden die Plasmidmengen und die Mengen der verwendeten Transfektionsreagenzien entsprechend erhöht. Für den
EMSA wurden konfluente Petrischalen (Durchmesser 9 cm, Fläche ca. 65 cm2) benutzt. Pro Petrischale wurden dementsprechend 13 µg DNA transfiziert und 39 µl Plus-Reagenz bzw. 26 µl Lipofectamin verwendet. Die Reaktion wurde mit 6,5 ml GMEM (10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin) gestoppt.
3.3.2 Transfektion von N2A-Zellen
(Lipofectamine Plus manual, Life Technologies)
Für die Transfektion wurden N2A-Zellen in 6-Loch-Platten (Durchmesser 35 mm, Fläche ca. 10 cm2) in 2 ml Medium kultiviert. Zwei Tage vor der Transfektion wurden 2 × 105 Zellen pro 35-mm-Vertiefung ausgesät. Nach Erreichen einer Zelldichte von 80-90% (nach ca. 48 Stunden) wurden die Zellen einmal mit DMEM (ohne FCS und Antibiotika) gewaschen. Pro 35 mm Vertiefung wurden 1-2 µg DNA transfiziert, dafür wurden 6 µl Plus-Reagenz und 4 µl Lipofectamin pro Vertiefung eingesetzt. Nach 3-6 stündiger Inkubation mit dem Transfektionsansatz (1 ml) wurde die Transfektion durch Zugabe von 1 ml DMEM (10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin) gestoppt. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet.
3.3.3 Transfektionen für Reportergen-Assays
Bei Kotransfektionen für Reportergen-Assays wurden pro 35-mm-Vertiefung jeweils 1 µg Reporterplasmid und 1 µg Effektorplasmid transfiziert. Bei Tripeltransfektionen erfolgte eine zusätzliche Transfektion von 100 ng Glucorticoidrezeptor (GR) pro 35-mm-Vertiefung. Pro Vertiefung wurden 6 µl Plus-Reagenz und 4 µl Lipofectamin eingesetzt. 6 h nach der Transfektion wurde die Reaktion mit 1 ml DMEM (10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin) gestoppt und in die mit GR transfizierten Vertiefungen Dexamethason (0,1 µM) zugesetzt.
3.3.4 Transfektionen für ChIP-Assays, Immunpräzipitationen und Western Blots zur Überprüfung der NFI-A-Aktivität
Hierfür wurden konfluente Kulturen in Petrischalen (Durchmesser 9 cm, Fläche ca. 65 cm2) transfiziert. Pro Petrischale wurden dementsprechend 13 µg DNA transfiziert und 39 µl Plus-Reagenz bzw. 26 µl Lipofectamin verwendet. Die Reaktion wurde nach 6 h mit 6,5 ml DMEM (10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin) gestoppt.
3.4 Lyse von CHO- und N2A-Zellen
3.4.1 Lyse von Zellen für die Western Blot-Analyse
48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen durch Zugabe von 400 µl Ripa-Puffer1 (150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1x Protease Inhibitor Complete) pro 35-mm-Vertiefung lysiert (1 h, 4°C, Wippe).
Bei größeren Ansätzen wurde die Menge an Lysispuffer entsprechend erhöht. Die Zellen wurden von den Platten geschabt und in ein 1,5-ml-Eppendorfgefäß überführt. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (15.000 g, 4°C, 10 min) entfernt, der Überstand mit 5x SDS-Page-Probenpuffer aufgekocht, erneut kurz bei RT zentrifugiert und gegebenfalls bei -20°C gelagert.
3.4.2 Lyse von Zellen für Reportergen-Assays
48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und pro Vertiefung in 150 µl 1x Reporterlysis-Puffer (Promega) lysiert. Die Zellen wurden von den Platten geschabt und in ein 1,5-ml-Eppendorfgefäß überführt. Nach 15 min Inkubation bei RT wurden Zelltrümmer durch 30 sec Zentrifugation (15.000 g) entfernt und jeweils 50 µl Überstand für die Luciferase- bzw. 10 µl für die Proteinbestimmung verwendet.
3.4.3 Lyse von Zellen für die Immunpräzipitation (siehe 2.4.1.2)
3.4.4 Lyse von Zellen für Western- Blots zur Überprüfung der NFI-A-Aktivität am L1-Promotor
48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen 2x mit PBS 2+ (0,5 mM CaCl2 und 2 mM MgCl2 in 1x PBS) gespült und zur Lyse mit 1 ml Ripa-Puffer 2 (150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1x Protease Inhibitor Complete) für 30 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden abgeschabt und in ein 1,5-ml-Eppendorfgefäß überführt. Die Zellsuspension wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und wieder aufgetaut. Nach einem Zentrifugationsschritt (10 min, 4°C, 1000 g) wurde der eine Teil des Überstands in entsprechenden Verdünnungen zur Proteinbestimmung verwendet. Der restliche Überstand wurde mit 5x Probenpuffer versetzt, kurz aufgekocht und nach einem weiteren kurzen Zentrifugationsschritt bei –20°C eingefroren. Für die Western Blot-Analyse wurden jeweils 10 und 25 µg Gesamtprotein verwendet.
3.5 Proteinextraktion aus Maushirn
Das Gesamthirn wurde Mäusen des entsprechenden Alters entnommen und in einem sterilen Glaspotter in 2 ml 1 x PBS unter Zusatz von 1x Protease Inhibitor Complete (Roche) homogenisiert. Zelltrümmer und Zellkerne wurden durch 10minütige Zentrifugation bei 4°C und 1000 g pelletiert. Der Überstand wurde in entsprechenden Verdünnungen zur Proteinbestimmung (siehe 2.1) verwendet. Für die Western Blot-Analyse wurden 10 µg Gesamtprotein verwendet.
3.6 Computerunterstützte Sequenzanalyse
Sequenzanalysen und –vergleiche wurden mit Hilfe des Lasergene-Programms DNASTAR durchgeführt (www.dnastar.com). Die folgenden Datenbanken
wurden für die Untersuchungen genutzt: Medline-, BLASTN- und BLASTP-Server des NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov).
IV ERGEBNISSE
1 NFI-A und L1
Der spezifische Transkriptionsfaktor NFI-A wird laut SAGE-Analyse in Hippocampi von GFAP/L1-Mäusen stäker exprimiert als in wildtypischen Kontrolltieren. Ferner weisen die Gehirne von NFI-A-defizienten Mäusen morphologische Veränderungen auf, die denen von L1-ko-Mäusen ähneln (das Neves et al., 1999). Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob NFI-A die Transkription des L1-Gens reguliert.
1.1 Die regulatorische Region des L1-Gens enthält Bindungsmotive für Transkriptionsfaktoren der NFI-Familie
Hierfür wurde zunächst die über mehr als 13 Kilobasen große regulatorische Region des murinen L1-Gens auf NFI-Bindungsstellen untersucht (Richard Gronostajski, State University of New York at Buffalo). Alle vier Mitglieder der NFI-Familie binden an die Konsensussequenz mit der Basenabfolge TTGGC (N)5GCCAA.
Im Idealfall besteht die Bindungssequenz für die Transkriptionsfaktoren der NFI-Familie in der regulatorischen Region eines Gens aus beiden fünfbasigen Motiven, die einen variablen Spacer eingrenzen. Man spricht dann von einer
„perfekten Bindungsstelle“, allerdings sind diese in der Natur eher selten.
Häufiger findet man Erkennungssequenzen, in denen 7-8 Übereinstimmungen in der Basenabfolge vorliegen.
Im ersten Intron der L1-Sequenz wurde eine perfekte NFI-Bindungsstelle gefunden, d.h., in der Basenabfolge des L1-Gens liegt eine völlige Übereinstimmung mit den beiden 5-basigen Motiven der Erkennungssequenz der NFI-Proteine vor (Abb. 7). Außerdem weist die variable Region starke Ähnlichkeit zum ersten Motiv auf. Dies ließ eine hohe Bindungsaffinität
16260 AATTGAATTT GTGACTCCTG GCTGCCTCCT GATGGAGCTT CAAATTGCTT AACATGACCT 16320 TCCTTTTGGG TGTTTTAATC TTTCCTTTAT ATTTTTTAAT TTGTGTGTTT ATGCCAGGAT 16380 GCTTACTTGG AGATCAGAGA ATAATTTGTT CAAATCAGCT CTCTCCTTAC ATTATATGGA
NFI_1/2per
|
>NFI_1/2per >NFI_per
| | |
>NFI_site_perfect |
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|| | | 16440 CTCCAGGGAG CAAACTCATG CTAT T TGGT CATCTTTACC CGTGGAACCA
16500 TCTTATCGGC CTCACTTACT TGCTTTTAAA ACTTAGGTGT TCTAGATGAG GCAC TCTACT 16560 TTCATAAGAT CCTGGTTGGA TGAATTTATT GAGGGCATCC AGATTAGGGT TCATGGCATC
TTGGC GCCAA G
Abb. 7: Sequenz der perfekten NFI-Bindungsstelle im ersten Intron der regulatorischen Region des L1-Gens. Kurz vor dem Translationsstartpunkt des L1-Gens befindet sich eine mit dem NFI-Erkennungsmotiv völlig übereinstimmende Sequenz auf dem L1-Gen.
Des weiteren finden sich über die gesamte regulatorische Region der L1-Sequenz verteilt mehr als 40 „halbe“ NFI-Bindungsstellen, diese bestehen entweder nur aus dem ersten oder dem zweiten 5-basige Bindungsmotiv (Abb. 8). Auch die halben NFI-Bindungsstellen besitzen physiologische Relevanz, da NFI-Proteine an diese spezifisch, aber mit verminderter Intensität binden (Gronostajski, 2000).
15300 CCTAACCCTG CTTCTCAGAC TCTCCTGCTT CCTCCTGCCT TTTTCTCACT CTGTCTGTCA
>NFI_1/2per
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>NFI_1/2per >NFI_1/2per
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| | | 15360
CCC GC TCCATCTG TAGAACACTT ACCCCCCCTT TTTGCCCTTC
15420 ATAGTGCTGA TGGGGGGTCA GGGCCTGCTG AGCTAACAAC CTTAGCTCTC TCTATAATTG
TTGGCAG TTGGC TTGGC
Abb. 8: Beispiel für „halbe“ NFI-Bindungsstellen in der regulatorischen Region des L1-Gens.
Diese Bindungsstellen bestehen aus nur einem 5-basigen Erkennungsmotiv der NFI-Proteine und sind im überwiegend ersten Intron der L1-Gensequenz lokalisiert.