Strategien zur Durchbrechung der Homodimerisierung

Nachdem in mehreren eigenen Ansätzen die Dimerisierung von CCR5 sowohl als Homodimer als auch als Heterodimer gezeigt wurde, wurden nun verschiedene in der Literatur beschriebene Ansätze zur Durchbrechung der Dimerisierung von Rezeptoren auf ihre Eignung hin überprüft.

2.2.4.1 Bedeutung von Ile52 und -Val150 für die homologe CCR5-Dimerisierung

In der Arbeitsgruppe um Mellado wurde postuliert, daß die Aminosäuren Ile52 der Transmembranregion 1 und Val150 der Transmembranregion 4 essenziell für die Dimerbildung sind. Die Autoren zeigten, daß die Inkubation von CCR5-exprimierenden Zellen mit zwei Peptiden, in denen die Aminosäuren Ile52 und Val150 (R5wt1 und R5wt4) enthalten waren, die Aktivierbarkeit und Dimerisierung intakter Rezeptoren blockieren konnte (HERNANZ-FALCON et al., 2004).

Um die zitierten Ergebnisse zu überprüfen und dann auf die mögliche Blockade von CCR5/C5aR-Heterodimeren anzuwenden, wurden die Peptide R5wt1 und R5wt4 in eigenen Versuchen getestet.

2.2.4.1.1 Einfluß der Blockade von CCR5-Ile52 und -Val150 auf die CCR5-Dimerisierung

Um den Einfluß der Peptide auf die CCR5-Dimerbildung zu untersuchen, wurden HEK-293-Zellen transient mit CCR5-Rluc und CCR5-GFP² transfiziert, und es wurde der Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer in unbehandelten Zellen und in Zellen, die mit einem Kontroll-Peptid oder den R5wt1- und R5wt4-Peptiden vorinkubiert wurden, gemessen. Man erkennt in der Abbildung 41, daß die Dimerbildung weder durch die Inkubation mit dem Kontrollpeptid noch durch die Inkubation mit den R5wt1- und R5wt4-Peptiden inhibiert wurde.

Abb. 41: Einfluß der R5wt1- und R5wt4-Peptide auf die CCR5-Homodimerisierung HEK-293-Zellen wurden in einer großen Schale bis zu 50 % Konfluenz angezogen und mit je 20 µg CCR5-pRluc-N2 und CCR5-pGFP²-N2 transient transfiziert. Die Zellen wurden mit BRET-Puffer auf eine Konzentration von 4 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt und für 30 min bei 37°C mit Puffer (0), 100 µg/ml Kontroll-Peptid (KoPep) oder je 50 µg/ml R5wt1- und R5wt4-Peptid inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, und es wurde das BRET-Signal in den einzelnen Ansätzen gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von einem von drei unabhängigen Experimenten in triplikater Bestimmung.

2.2.4.1.2 Einfluß der Blockade von CCR5-Ile52 und -Val150 auf die funktionelle Regulation des CCR5

Neben dem Einfluß der Peptide auf die Dimerisierung wurde die Funktionalität des CCR5 nach Peptid-Behandlung untersucht. Dazu wurden RBL-CCR5-Zellen für 30 min mit 100 µg/ml Kontroll-Peptid oder je 50 µg/ml R5wt1- und R5wt4-Peptid vorinkubiert, und es wurden die Phosphorylierung im ELISA, die Calcium- und Glucosaminidase-Freisetzung und die Internalisierung des CCR5 nach Stimulation mit RANTES gemessen.

Man sieht in der Abbildung 42, daß die Inkubation des CCR5 mit den Peptiden R5wt1 und R5wt4 keinen signifikanten Einfluß auf die PKC-vermittelte Phosphorylierung des CCR5 zeigte. Dagegen wurde die GRK-vermittelte Phosphorylierung nach 10 minütiger Stimulation mit RANTES unter dem Einfluß von R5wt1 und R5wt4 um etwa 50 % im Vergleich zu Kontroll-Peptid behandelten Zellen reduziert.

Abb. 42: Einfluß der R5wt1- und R5wt4-Peptide auf die CCR5-Phosphorylierung

RBL-CCR5-Zellen wurden in kleinen Schalen konfluent angezogen und für 30 min mit 100 µg/ml Kontroll-Peptid oder je 50 µg/ml R5wt1- und R5wt4-Peptid vorinkubiert.

Anschließend wurden die Zellen für 5 min mit 200 nM PMA oder für 30 sec oder 10 min mit 30 nM RANTES in Peptid-haltigem Medium stimuliert. Nach dem Aufschließen der Zellen in Lysepuffer wurde der CCR5 mit T21 an die ELISA-Platte gebunden. Der Nachweis der Phosphorylierung des Rezeptors erfolgte mit den biotinylierten Primärantikörpern V14 bzw.

E11 in einer Konzentration von 1 µg/ml und Peroxidase-gekoppeltem Streptavidin (1:2500). Als Substrat diente ABTS. Die Phosphorylierung ist angegeben als relative Einheit (r.E.) im Vergleich zu einem mitgeführten CCR5-phospho-CT-BSA-Standard. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei durchgeführten mit gleichem Ergebnis.

In keiner der anderen funktionellen Untersuchungen (Calcium- und Glucosaminidase-Freisetzung, Internalisierung des CCR5) konnte eine signifikante Reduktion der Rezeptorfunktionalität nach Inkubation mit den R5wt1- und R5wt4-Peptiden festgestellt werden, wie von HERNANZ-FALCON et al.(2004) beschrieben worden war. Daher waren diese Peptide für die eigenen Untersuchungen nicht verwendbar.

2.2.4.2 Bedeutung des ersten Leucins der ersten Transmembrandomäne für die Homodimerbildung

In einer Studie der Arbeitsgruppe von Baranski wurde eine C5aR-cDNA-Bank angefertigt, in der die Transmembranregionen des C5aR zufällig mutagenisiert wurden.

Aus den erhaltenen Daten wurde ein putativer dreidimensionaler Aufbau des C5aR erstellt, in dem Aminosäuren der ersten und der zweiten Transmembranregion als mögliche Interaktionsstellen von Rezeptordimeren prognostiziert wurden. Dabei war auffällig, daß Leu41 als einzigen Austausch ein Cystein tolerierte, das wie das Leucin

zur Ausbildung von Disulfidbrücken befähigt ist (BARANSKI et al., 1999, GEVA et al., 2000).

Ein Sequenzvergleich der ersten Transmembranregion von C5aR, CCR1 bis CCR5 und dem Rhodopsin-Rezeptor zeigte, daß Leu41 eine hoch konservierte Aminosäure an dieser Position darstellt. Daher wurden C5aR- und CCR5-Rezeptormutanten erstellt, in denen das C5aR-Leu41 und das entsprechende CCR5-Leu36 gegen Arginin mutagenisiert wurden, und es wurde die Expression und Aktivität dieser Rezeptoren untersucht.

2.2.4.2.1 Herstellung der Leu-Arg-Rezeptormutanten

Die Leu-Arg Mutationen wurden mit Hilfe des QuickChangeII-Mutagenesis-Kit von Stratagene in die Rezeptoren eingeführt. Dazu wurde der CCR5-L36R mit den Primern CCR5-L36Arg-For und CCR5-L36Arg-Back aus dem Plasmid CCR5-pBos synthetisiert und der C5aR-L41R mit den Primern C5aR-L41A-For und C5aR-L41A-Back aus dem Plasmid C5aR-pBos amplifiziert. Beide Konstrukte wurden in den E. coli-Stamm XL1-blue transfiziert und die Basenabfolge der mutagenisierten Rezeptoren wurde mittels Sequenzieren verifiziert.

Zur stabilen Transfektion wurden die Plasmide mit PvuI linearisiert, und es wurden je 18 µg DNA zusammen mit je 2 µg mit ScaI linearisiertem pEF1/Myc-HIS-A-Plasmid in RBL-2H3-Zellen transfiziert.

2.2.4.2.2 Expression und Aktivität der Leu-Arg-Rezeptormutanten

Es wurden etwa je 100 Klone RBL-CCR5-L36R und RBL-C5aR-L41R im FACS mit den Antikörpern T21 bzw. S5/1 auf ihre Rezeptorexpression untersucht. Dabei zeigte in nicht-permeabilisierten Zellen kein Klon eine signifikante Oberflächenexpression von CCR5 bzw. C5aR. In permeabilisierten Zellen konnte dagegen in einer Vielzahl der getesteten Klone eine signifikante Rezeptormarkierung festgestellt werden (Tab. 11).

Dieses Ergebnis zeigte, daß die mutagenisierten Rezeptoren zwar synthetisiert, aber nicht auf der Zelloberfläche exprimiert wurden. Dadurch konnte auch nur eine minimale Glucosaminidase-Freisetzung nach Stimulation der Zellen mit RANTES bzw. C5a detektiert werden (Tab. 11).

Tab. 11: Expression und Aktivität der RBL-Rezeptor-Leu-Arg-Zellreihen

Gezeigt ist die Expression und Aktivität der RBL-CCR5-L36R- und RBL-C5aR-L41R-Zellreihe. Die Rezeptorexpression wurde im FACS mit 10 µg/ml des Primärantikörpers T21 (CCR5-L36R) bzw. S5/1 (C5aR-L41R) und dem Sekundärantikörper Ziege-Anti-Maus-FITC (1:100) überprüft. Die Markierung der Zellen erfolgte dabei in FACS-Puffer (nicht perm.) oder im permeabilisierenden Saponin-Puffer (perm). MCF gibt die Expression der Rezeptoren als

„mean channel of fluorescence“ an. Das NAGA-Maximum gibt Auskunft über die prozentuale Glucosaminidase-Freisetzung verglichen mit Zellen, bei denen durch Triton-Lyse sämtliches Enzym freigesetzt wurde. Die Werte entsprechen Mittelwerten aus mindestens drei unabhängigen Messungen.

2.2.4.2.3 Homodimerisierung der Leu-Arg-Rezeptormutanten

Um trotz der mangelnden Expression die Fähigkeit der Leu-Arg-Rezeptoren zur Homodimerisierung zu überprüfen, wurden analog zu den Ergebniskapiteln 2.1.1.1 und 2.2.1.4.1 BRET-Konstrukte erstellt, in denen die Rezeptoren an Luciferase bzw. GFP² gekoppelt wurden. Es wurden 0,3 µg Rezeptor-Rluc-DNA und 3 µg Rezeptor-GFP²– DNA transient in HEK-293-Zellen transfiziert, und es wurde der Energietransfer der CCR5-Homodimere bzw. C5aR-Homodimere gemessen. Man sieht in der Abb. 43, daß das Ausmaß des Energietransfers stark variierte, je nachdem ob der Luciferase-gekoppelte, der GFP²-gekoppelte oder beide Rezeptoren das mutagenisierte Leucin der ersten Transmembranregion enthielten. Das BRET-Signal von Rezeptor-Heterodimeren ist normalerweise jedoch unabhängig davon, welcher Rezeptor Luciferase- bzw. GFP² -gekoppelt verwendet wird. Daher war trotz des beobachteten Energietransfers nicht eindeutig, ob es sich hier um echte Rezeptordimere handelte, oder ob der Energietransfer durch die vermutliche Aggregation der Rezeptoren im ER und die daraus resultierende räumliche Nähe der Rezeptoren untereinander erzeugt wurde.

Zusammenfassend konnte mit den hier angewandten Methoden die Bedeutung des ersten Leucins der Transmembranregion 1 von CCR5 und C5aR für die Rezeptordimerisierung nicht eindeutig geklärt werden.

Abb. 43: Einfluß der Leu-Arg-Mutation der TM1 auf die homologe CCR5- bzw. C5aR-Dimerisierung

Es wurde die homologe Rezeptordimerisierung von CCR5 bzw. C5aR bestimmt, wobei entweder jeweils ein BRET-Konstrukt oder beide Konstrukte ein gegen Arginin mutagenisiertes Leucin (Rez-LR) in der ersten Transmembrandomäne aufwiesen. Dazu wurden HEK-293-Zellen in unterschiedlichen Kombinationen transient mit 0,3 µg Rluc- und 3 µg GFP²-gekoppeltem Rezeptor transfiziert, und nach 48 h wurde der Energietransfer nach Aktivierung der Luciferase mit ihrem Substrat DeepBlueC gemessen. Das BRET-Signal ergibt sich aus dem Quotienten aus GFP²-Fluoreszenz und Rluc-Lumineszenz abzüglich des BRET-Signals von Zellen, die lediglich mit dem Rezeptor-Rluc-Konstrukt transfiziert wurden. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens 2 Versuche mit gleichem Ergebnis.