Klonierungstechniken und Manipulation von Nukleinsäuren

2.2.1Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

2.2.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA (STET-Methode)

Die Zellen aus 1,5 ml einer Übernacht-Kultur wurden durch Zentrifugation bei 13000 rpm für 30 sec bei RT geerntet und in 400 µl STET-Puffer (8 % Saccharose, 0,5 % Triton X-100, 50 mM EDTA, pH 8,0, 10 mM Tris, pH 8.0) resuspendiert. Die Proben wurden für 40 Sekunden in kochendem Wasser aufgeschlossen und die dadurch entstandenen Zelltrümmer nach 30 minütiger Zentrifugation bei 4°C mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers entfernt. Die Plasmid-DNA wurde durch Zugabe von 50 µl NaOAc (3 M, pH 4,8) und 500 µl Isopropanol gefällt und durch eine 10 minütige Zentrifugation bei 4°C abzentrifugiert. Das Sediment wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl TE-Puffer und 1µl RNase A (10 mg/ml) aufgenommen. Die Plasmid-DNA wurde bei –20°C aufbewahrt.

2.2.1.2 Mini-Präparation

Zur Aufreinigung von Plasmid-DNA, die für transiente Transfektionen (siehe 2.3.5.3) oder Sequenzierungsreaktionen eingesetzt werden sollte, wurde das Plasmid-Aufreinigungs-Kit AX 20 der Firma MACHEREY-NAGEL (Düren, D) nach Angaben des Herstellers verwendet.

2.2.1.3 Maxi-Präparation

Zur Aufreinigung großer Mengen an Plasmid-DNA wurde das Maxi-Plasmid-Aufreinigungs-Kit AX 500 der Firma MACHEREY-NAGEL (Düren, D) nach Angaben des Herstellers verwendet.

2.2.2 Phenol-Fällung von DNA

Zur Aufreinigung großer Mengen an DNA nach Restriktion wurde diese einer Phenolfällung unterworfen. Dazu wurde die DNA-Lösung mit gleichem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1) versetzt, vermischt und für 15 sec abzentrifugiert. Dann wurde die obere Phase in ein neues steriles E-cup überführt und die DNA nach Zugabe von 1/10 Volumen 3 M NaAcetat und 2-3 Volumen 96 % eiskaltem Ethanol für 30 min bei –20°C gefällt. Anschließend wurde die DNA für 5 min bei 4°C abzentrifugiert, das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen und kurz getrocknet.

Schließlich wurde die DNA in TE-Puffer aufgenommen.

2.2.3 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA

Die Konzentrations- und Reinheitsbestimmung gelöster DNA erfolgte über die Messung der optischen Dichte der DNA-Lösungen bei 260 nm und 280 nm. Die Wellenlänge von 260 nm entspricht dem Absorptionsmaximum der Nukleotide AMP und UMP, wobei eine OD260 von 1 einer Konzentration von 50 µg/µl doppelsträngiger DNA entspricht.

Der Quotient aus OD260 und OD280 ist ein Maß für die Reinheit der DNA-Lösung. Er sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen; ein geringerer Wert weist auf Verunreinigungen durch Proteine hin.

Standardmäßig wurden 2 µl DNA Lösung mit 98 µl Puffer verdünnt und die Konzentration der Lösung gegen einen Leerwert aus reinem Puffer bestimmt.

2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion („PCR“)

Polymerase-Kettenreaktionen wurden mit dem thermostabilen Enzym Taq-Polymerase durchgeführt. Üblicherweise hatten die Ansätze folgende Zusammensetzung:

1 µl Polymerase

5 µl Polymerase-Puffer 1 µl Primer 1

1 µl Primer 2 1 µl dNTPs

1 µl DNA-Template 40 µl H₂O bidest.

Die PCR-Zyklen wurden durch einen 3-minütigen Denaturierungsschritt eingeleitet und durch einen finalen Syntheseschritt von 5 min abgeschlossen. Ein üblicher Zyklus bestand aus: 0,5 - 1 min 94°C Denaturierung

0,5 - 1 min 54°C Annealing

0,5 - 1 min 72°C Elongation ( etwa 1 min / 1 kb Amplifikatgröße).

Zur Synthese von modifizierter Rezeptor DNA wurde die Accu Taq™ DNA-Polymerase verwendet. Diese besitzt eine Korrekturlese-Fähigkeit und zeichnet sich durch eine geringe Fehlerrate der Amplifikate aus. Entsprechend den Herstellerangaben wurde dem PCR-Ansatz zusätzlich 1 µl DMSO zugesetzt. Das Temperaturoptimum der Accu-Taq liegt bei 68°C und es wurden üblicherweise 20 Amplifizierungszyklen durchlaufen.

Zur Synthese von Amplifikaten, die nicht weiter verwendet wurden, wurde die Red Taq™ DNA-Polymerase verwendet. Hier wurden üblicherweise 30 Zyklen durchlaufen.

Zur Amplifikation genomischer Templates wurde die Hot Star Taq verwendet. Hier ging den Zyklen eine Aktivierung der Hot Star Taq für 5 min bei 95°C voraus.

2.2.5 Restriktion von DNA

Für analytische Restriktionsreaktionen wurden ca. 10 µg DNA mit 1-2 Units Restrik-tionsenzym in einem Volumen von 20 µl für 2-3 h bei 37°C inkubiert. Für die Restriktion präparativer Mengen an DNA wurden entsprechend größere Volumina und

Mengen Enzym eingesetzt. Reaktionspuffer wurden nach den Angaben des Herstellers verwendet.

2.2.6 Dephosphorylierung von DNA

Zur Minimierung von Vektoreigenligation wurde die geschnittene Vektor-DNA gelegentlich einer Dephosphorylierung durch CIAP (Calf Intestine Alcaline Phosphatase) unterzogen. Dazu wurde der Restriktionsansatz entweder durch Hitzeinaktivierung für 15 min bei 65°C abgestoppt und dann nach Zugabe von 1 µl CIAP für 1 h bei 37°C inkubiert, oder die DNA wurde nach Restriktion zunächst aufgereinigt und anschließend mit 1 µl CIAP und 1/10 Volumen CIAP-Puffer für 1 h bei 37°C inkubiert.

2.2.7 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Auftrennung und Analyse von DNA-Fragmenten wurde die DNA-Lösung mit 0,1 Volumen DNA-Ladepuffer (20 % w/v Ficoll 400, 0,25 % w/v Bromphenolblau, 100 mM EDTA, 1 % w/v SDS pH 8,0) versetzt und über ein horizontales 0,8 %iges Agarosegel in TBE-Puffer in Gegenwart von 0,5 µg/ml Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt. DNA-Banden wurden mittels eines UV-Transilluminators (254 nm) detektiert.

2.2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose

Um DNA-Fragmente aus dem Agarosegel zu isolieren, wurde das QIAquick Gel Extraktions Kit gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers verwendet. Hierbei wurden zunächst die DNA-Fragmente aus dem Gel herausgeschnitten und gewogen. Es wurden 3 Volumen des Puffers QX1 hinzugegeben und für 10 min bei 50°C inkubiert.

Sobald sich das Gelfragment vollständig gelöst hatte, wurde das Gemisch auf die QIAquick-Säule gegeben und abzentrifugiert. Um die an die Säule gebundene DNA zu waschen, wurden 0,75 ml PE-Puffer hinzugegeben und erneut zentrifugiert. Schließlich wurde die DNA mit 30 - 50 µl EB-Puffer eluiert.

2.2.9 Ligation von DNA-Fragmenten

Lineare DNA-Fragmente mit kohäsiven oder glatten Enden wurden mit der T4-DNA-Ligase von FERMENTAS ligiert.

Dazu wurde die DNA in einem Reaktionsgemisch in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 2 µl Ligationspuffer, 2 µl PEG 4000 und 5 Units T4-DNA-Ligase für 2-3 h bei RT ligiert. Die Konzentration an DNA betrug zwischen 1 und 10 µg/ml, das molare Verhältnis Vektor/Insert-DNA lag zwischen 1:2 und 1:14. Im Anschluß an die Ligationsreaktion wurde der Ansatz für 10 min bei 65°C abgestoppt und die DNA ohne weitere Reinigung zur Transformation eingesetzt.

2.2.10 Sequenzierung von DNA

Zur Verifizierung mutagenisierter Rezeptor-DNA wurde diese bei der Firma SeqLab (Göttingen, D) unter GC-Bedingungen sequenziert.