Der CC-Chemokinrezeptor 5 (CCR5)

Der CC-Chemokinrezeptor 5 (CCR5) wird auf Monozyten, Makrophagen, ruhenden T-Lymphozyten und unreifen dendritischen Zellen exprimiert. Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen ist CCR5 unter anderem deshalb geworden, weil er nicht nur die Migration von Zellen induziert, sondern weil er neben CD4 den essentiellen Corezeptor für die zelluläre Infektion mit M-tropischen (R5) Stämmen von HIV-1 darstellt (CHOE et al., 1996). Es konnte gezeigt werden, daß HIV-1 für den Eintritt in die Zielzelle mit seinem Glykoprotein gp120 sowohl an CD4 als auch an den N-Terminus von CCR5 bindet, wobei der Virus-Eintritt in die Zelle unabhängig von CCR5-induzierter G-Protein-Kopplung oder Calcium-Freisetzung ist (FARZAN et al., 1997; FARZAN et al., 1999). Individuen, die homozygot für ein CCR5-∆32-Defektallel

sind, exprimieren einen trunkierten Rezeptor, der nicht an der Zelloberfläche exprimiert wird. Diese Merkmalsträger sind fast vollständig vor einer HIV-1-Infektion geschützt, da der M-tropische Stamm vorwiegend für die Übertragung des Virus verantwortlich ist (LIU et al., 1996; SAMSON et al., 1996; BENKIRANE et al., 1997; KINTER et al., 2000). Das Fehlen von pathophysiologischen Auswirkungen in Individuen, die keinen funktionellen CCR5 exprimieren, macht CCR5 zu einem wichtigen Ansatzpunkt in der Entwicklung antiviraler Pharmazeutika (NANSEN et al., 2002).

Die wichtigsten physiologischen Liganden von CCR5 sind die CC-Chemokine RANTES (CCL5), MIP-1α (CCL3), MIP-1ß (CCL4), MCP-2 (CCL8) und HCC-1 (CCL14) (RAPORT et al., 1996). Es wird postuliert, daß Chemokine in zwei Schritten an CCR5 binden. Zunächst interagiert der Kern des Chemokins mit extrazellulären Domänen des CCR5, wobei die zweite extrazelluläre Schleife des CCR5 die Ligandspezifität determiniert. Anschließend bindet der Chemokin-N-Terminus an Aminosäuren der Transmembranregion des CCR5 und triggert so die Rezeptoraktivierung (CLARK-LEWIS et al., 1995; SAMSON et al., 1997). Es konnte auch gezeigt werden, daß die Chemokine RANTES und MIP-1α unterschiedliche extrazelluläre Aminosäurereste von CCR5 binden (BLANPAIN et al., 2003).

Die Aminosäuresequenz und der Aufbau von CCR5 sind in der Abbildung 5 dargestellt.

Es konnte bisher noch für keinen Chemokinrezeptor eine Kristallstruktur ermittelt werden, so daß das gezeigte computergenerierte Modell in Anlehnung an die Kristallstruktur von Rhodopsin durch Vergleich korrespondierender Bereiche erstellt wurde. CCR5 besteht aus 352 Aminosäuren und besitzt eine kalkulierte molekulare Masse von 40,6 kDa (SAMSON et al., 1996; RAPORT et al., 1996). Die posttranslationale Modifizierung des CCR5-Aminoterminus durch O-Glykosylierung und Tyrosin-Sulfatierung ist essenziell für die hoch affine Ligand-Bindung (FARZAN et al., 1999). Zugleich ist sie verantwortlich für die breite Rezeptorbande nach Auftrennung über SDS-PAGE. Die zwischen den Cysteinen der ersten und zweiten extrazellulären Schleife gebildete Disulfidbrücke ist in der GPCR-Familie hoch konserviert. Zusätzlich bilden Chemokinrezeptoren wie CCR5 noch eine zweite Disulfidbrücke zwischen Cysteinen des Aminoterminus und der dritten extrazellulären Schleife aus. C-terminal wird CCR5 an den Cysteinen 321, 323 und 324 palmitoyliert und in der Zellmembran verankert, wodurch eine vierte intrazelluläre Schleife gebildet

wird. Es konnte gezeigt werden, daß die Palmitoylierung des Rezeptors wichtig für die Phosphorylierung und Internalisierung des Rezeptors ist, und daß ein trunkierter CCR5 ohne die Cysteine in seiner Zelloberflächenexpression eingeschränkt ist (KRAFT et al., 2001; VENKATESAN et al., 2001).

Abb. 5: Schematischer Aufbau und Aminosäuresequenz von CCR5

Gezeigt ist die Aminosäuresequenz im Einbuchstaben-Code und der schematische Aufbau von CCR5. Der Aminoterminus liegt extrazellulär, der Transmembranbereich ist grau unterlegt. Für die Stabilität und Funktion des CCR5 wichtige Aminosäuren sind schwarz gekennzeichnet. Die extrazellulären Verbindungen der Cysteine stellen Disulfidbrücken dar.

(Abb. modifiziert aus OPPERMANN, 2004)

Nach Stimulation mit seinen natürlichen Liganden wird CCR5 an vier im C-Terminus gelegenen Serinen phosphoryliert. Diese Serine stellen die einzigen Phosphorylierungsstellen dar, da weder eine Threonin-Phosphorylierung noch eine Rezeptorphosphorylierung an den intrazellulären Schleifen in einem C-terminal trunkierten CCR5 gefunden wurde (OPPERMANN et al., 1999; OLBRICH et al., 1999;

KRAFT et al., 2001). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß eine CCR5-S/A-Mutante mit Austausch aller vier C-terminalen Serine gegen Alanin einen Defekt in der ß-Arrestin-Bindung, in der Rezeptor-Internalisierung und der Desensibilisierung aufweist (KRAFT et al., 2001). Die homologe Phosphorylierung des CCR5 wird primär durch die Kinasen GRK2 und GRK3 vermittelt (OPPERMANN et al., 1999). Es

konnten für zwei der vier potentiellen Phosphorylierungsstellen monoklonale, phosphospezifische Antikörper hergestellt werden, mit denen der Verlauf und die Regulation der Phosphorylierung an diesen zwei Positionen dokumentiert werden kann.

Dabei zeigte sich, daß Serin 337 ausschließlich durch PKC phosphoryliert wird, Serin 349 dagegen durch GRKs (POLLOK-KOPP et al., 2003).

4. Ziele dieser Arbeit

Aufgabe dieser Arbeit war zum einen die systematische Untersuchung der Bedeutung der C-terminalen Phosphorylierungsstellen des CCR5 für die ß-Arrestin-Bindung, Internalisierung und Desensibilisierung des Rezeptors. Dazu sollten verschiedene CCR5-Mutanten, in denen die Serine in unterschiedlicher Anzahl und Position gegen Alanin substituiert waren, stabil in RBL-2H3-Zellen exprimiert und die Rezeptoreigenschaften charakterisiert werden. Weiterhin sollte die Bedeutung des konservierten DRY-Motivs innerhalb der Rezeptors für die ß-Arrestin-Bindung an CCR5 untersucht werden.

Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit sollte überprüft werden, ob CCR5 homo- und heterodimere Strukturen bilden kann und inwieweit das klassische Modell der Rezeptorregulation (Abb. 4) durch diese neuen Kenntnisse modifiziert werden muß.

Dazu sollten zwei CCR5-Mutanten mit Defekten in der Ligandbindung einerseits und der C-terminalen Phosphorylierbarkeit andererseits zusammen auf einer Zellreihe exprimiert werden. Es sollte geprüft werden, ob die Homodimerisierung beider Rezeptoren bei gemeinsamer Expression auf einer Zelle den jeweiligen Defekt in Bezug auf Rezeptorphosphorylierung, ß-Arrestin-Bindung und Internalisierung komplemen-tieren kann. Desweiteren sollte untersucht werden, ob CCR5 heterologe Rezeptordimere mit zwei weiteren GPCRs (C5aR und AT1aR) bilden kann und ob die Hetero-dimerisierung funktionelle Konsequenzen für die Regulation von CCR5 aufweist.

Schließlich sollte die Bedeutung des Rezeptor-C-Terminus für wichtige Rezeptorfunktionen wie Phosphorylierung und ß-Arrestin-Bindung überprüft werden.

Dazu sollten Rezeptorchimären hergestellt werden, in denen die C-Termini von CCR5 und C5a-Rezeptor ausgetauscht wurden, und es sollten die Rezeptoreigenschaften dieser Chimären untersucht werden.