2
3
4 5
6
Abbildung 2.0.1. Der modulare Aufbau von CAR im
Überblick: Die einzelnen Module arbeiten unabhängig
voneinander,werdenaberimLaufedes
Rekonstruktions-prozesses inPfeilrichtung abgearbeitet (1-6).
sog. Pattern-Modus eingefügt werden. Hierbeiwird
berücksich-tigt, daÿ die scheinbare Vergröÿerung des Mikroskops zwischen
den Aufnahmenvariieren kann.
4. Indiesem Schritt können nun auchdie Stauchungen, die vor
al-lembeimDünnstschneiden auftreten, korrigiert werden
(Squee-zing).
5. ImContour-ModuskönnendieKonturdatenmanuellerfaÿt
wer-den. Bei nichtspezisch gefärbtemZellmaterialistnurbegrenzt
aneine semiautomatische Datenerfassung denkbar.
6. Im letzten Arbeitsschritt wird aus den gewonnenen, planaren
Konturdaten ein virtuelles Modell des Objektes erzeugt. Auf
diesenPunkt wird ausführlich imKapitel3 eingegangen.
In den folgenden Abschnitten sollen die einzelnen Arbeitsschritte und
die jeweils steuerbaren und bestimmbaren Parameter dargestellt
wer-den. So wird anhandeiner baumartigenDarstellung 2
, der Aufbau des
jeweiligen Parameterfeldes schematisch dargestellt. Die einzelnen
Pa-rameterknotenstellen i.a.lineareTransformationendar, dieje nach
Arbeitsschritt zur Korrektur eines bestimmten Fehlers, der im
vo-rigen Kapiteldiskutiert wurde (siehe Seite 19), dient. Diese linearen
Transformationen wollen wir, wie in der Computergraphik üblich, in
sog. homogenisierten Koordinaten darstellen 3
.
2
wieimAnhangin KaptielAnähererläutertwird
3
Top
P 1 P
2 P
n
S p Ebenen Objekte
... ....
... ... ... .... ....
... ...
...
Abbildung 2.1.1. Unterhalbdes Top-Knotens,können
mehrere Projekte P
1 bisP
n
verwaltet werden. Für jedes
einzelne ProjektwerdeninS
p
dieProjektparameter,wie
Vergröÿerungund zSchnittdicke abgelegt.
Wir betrachten hierzu speziell die linearen Transformationen der
Rotationinder Ebene, der Skalierungundder Translation. Diese
wer-den imweiteren wie folgtabgekürzt:
R :=
2.1. Das Projekt
Im Hauptmodus des Programms, dem sog. Projekt-Modus, werden
die für einProjekt wichtigen Parameter eingestellt und in der
Daten-struktur abgelegt, wie es in Abbildung (2.1.1) angegeben ist. Eine
Erläuterung der einzelnen Knotensymbolendet der Leser in Anhang
A. Die Parameter sind imeinzelnen:
1. DerProjektname
2. DerProjektpfad
3. DieVergröÿerung
4. DiezSchnittdicke
Die für die Rekonstruktion wichtigsten Parameter sind oensichtlich
die Vergröÿerung, mit der der Datensatz aufgenommen wird und die
durchschnittlichezDickedereinzelnenSchnitte. WiewirimAbschnitt
1.2.2 gesehen haben, wird die tatsächlich erzielte Schnittdicke
durch-aus von der am Mikrotom eingestellten abweichen. Eine Schätzung
der tatsächlichen Schnittdicke erlaubt dabei ein Blick in die Tabelle
1.2.2. Daher ist in CAR vorgesehen, im ProjektModus lediglich eine
mittlereSchnittdickeanzugeben. Diesewird inEinheiten dersog.
Pro-jekteinheit erfaÿt, welche auÿerdem die Grundeinheit für die Ausgabe
der berechneten Parameter wieVolumenundOberäche bildet(z.B.in
Nanometer oder Mikrometer).
Die Transformationsmatrix, die im wesentlichen eine Skalierung
darstellt,erlaubtes, daÿ dieKonturdaten inEinheiten des Bildraumes
erfaÿt werden. Erst nach der Anwendung der Projektskalierung S
p ,
werden die Koordinaten in den Objektraum der Zelle transformiert.
Die Skalierungsmatrixsieht imwesentlichen wie folgtaus, wenn s
z die
zSchnittdicke und m dieVergröÿerungbezeichnet:
S
WiedietatsächlicheSchnittdickefürjedeneinzelnenSchnitteingestellt
werden kann, sehen wir im nächsten Abschnitt beim sog. Alignment
Modus.
Die Parameter 1 und 2 in der obigen Auistung haben mehr
Be-deutung beider Anwendung von CARin der Praxisund sollen hier der
Vollständigkeithalber erklärt werden:
Da, wie in Schema (2.1.1) zu sehen ist, das Datenformat zur Ablage
mehrerer sog. Projekte konzipiertist, gibt der Projektnamen lediglich
einen Bezeichner wieder, der das Projekt eindeutig identiziert. Der
Projektpfad gibt den Datenpfad an 4
, unter dem die abgelegte
Bildin-formation zu nden ist. Zusammenmit der Tatsache, daÿ in der CAR
DateilediglichVerweise(Links)aufdiebenutztenBilddatenverwendet
werden,ergibtsicheininderPraxisnichtzuvernachlässigenderVorteil
der Verschiebbarkeit und Austauschbarkeit der Bilddaten: So können
die Bilddaten ohne weiteres auf CD gebrannt oder auf der F
estplat-te verschoben werden, ohne daÿ dieeinzelnen Links auf die Bilddaten
aktualisiert werden müÿten. Es muÿ lediglich der Projektpfad, wie er
im ProjektModus speziziert wurde, geändert werden. Auÿerdem ist
durch dieTatsache, daÿ vonden Bilddaten,sind sieeinmal eingelesen
4
dieserkannbeiErweiterungdesOpenInventorDatenformatesaufVRMLauch
Ebenen
T 1 E
1 T
2 E
2 T
m E
... .... m
...
... ....
... ....
...
...
...
Abbildung 2.2.1. Unter dem Hauptebenen-Knoten
sinddieeinzelnenSchnittebenenangeordnet(E
1 bisE
n ).
Diesen gehtjeweilsdieTransformationderFormT
a
vor-aus, die das Alignment der Ebene zur vorhergehenden
Ebene beschreibt. Diese Transformationen kumulieren
sich entlang des Renderpfades von oben nach unten,
bzw. vonlinks nachrechts.
(siehe Abschnitte 2.2 und 2.3), die Bildgröÿe in absoluten
Koordina-ten abgespeichert wird, das Verwenden von Bildern in
unterschiedli-chen Auösungs- oder Kontrastierungsstufungen möglich. Dadurch ist
das Programm für Arbeiten auf Bildpyramiden vorbereitet, was eine
erhebliche Arbeitserleichterung und -beschleunigung bei sehr groÿen
Datenmengen, wie imBeispielder Calyx von Held, bewirken kann.
2.2. Das Alignment
Im AlignmentModus werden die einzelnen Schnittebenen, die
je-weils einem Ultradünnschnitt entsprechen, aufeinandergestapelt und
nach Schema (2.2.1) in die CARDatei einsortiert. Maÿgebliche
Para-meter sind hier:
1. DerEbenenname
2. DieSchrittweite der Ebene in zRichtung
3. DieTranslationT
4. DieRotation R
Der Ebenename ist wie der Projektname hauptsächlich in der
praktischen Anwendung von Nutzen. Hierdurch ist es möglich, die in
der Datei abgelegten Schnittebenen über den Ebenennamen mit
ei-ner eindeutigen Bezeichnung und Lokation der Ultradünnschnitte in
Verbindung zu bringen, z.B. mit der Gridboxnummer des jeweilig
mi-kroskopierten Grids.
DieParameter2-4spielenfürdieRekonstruktioneinewichtige
Rol-le. Siedienenimwesentlichen derRegistrierung(engl. Alignment)der
Bilddaten. DasAlignmentwirdhier ohne Korrekturen, die der
Verfor-mung der Schnitte durch das UltramikrotomRechnung tragen,
durch-geführt. Es werden also lediglich Translation T und Rotation R für
Wie wir in Abbildung (2.2.1) sehen können, ist die interne
Daten-struktur der CARDatei so angelegt, daÿ T und R die
Relativorientie-rung derEbene E
n
zuder Ebene E
n 1
wiedergibt. Dieswirddurchdie
Verwendung eines sog.Group-Knotens imInventordatenformat
sicher-gestellt (sieheAnhangA fürnähereInformationen),der eine
Kumulie-rung der linearen Transformation entlang des Renderpfades, wie er in
Abbildung (2.2.1)angegeben ist,erlaubt.
Dieses Prinzipder relativen Orientierung der einen Ebene zur
vor-hergehenden isteinGrundprinzip inCAR: Dieses Vorgehen spiegeltdie
Tatsache wider, daÿ aufeinanderfolgende Schnitte als zueinander
ähn-lich, auch im mathematischen Sinne, betrachtet werden können. Die
Ähnlichkeit des Schnittes E
n
zu den Folgeschnitten E
n k
geht mit
wachsendem k, was einer ansteigenden Schnittdicke entspricht,
ver-loren. Daher ist eine starke Gewichtung der Relativorientierung von
E
n zu E
n 1
evident.
WeiterhinhatdiesesPrinzipeinenhohenpraktischenNutzen:
Müs-sen Nachkorrekturen amDatensatz vorgenommen werden, soreicht es
aus, dienochschlecht registriertenSchnitte zu verändern, währenddie
anderen Relativorientierungenvondiesen Änderungen unberührt
blei-ben. Dies erspartbeigroÿen Datensätzen viel Zeit und Arbeit.
Hat man die genaue Schnittdicke exakt bestimmt, so kann man
die Anpassung der zSchrittweite von einem Schnitt zum nächsten in
Vielfachender im ProjektModus spezizierten mittlerenSchnittdicke
angeben. SolltealsoeinSchnitt beiderPräparation verlorengegangen
sein, so wird die relative Schnittdicke für den betroenen Schnitt auf
z = 2 gesetzt. Mit dieser Abweichung vom Wert 1 ist es also
mög-lich, Variationen der Schnittdicke, wie sie beim Ultradünnschneiden
vorkommen, zu kompensieren.
Das Alignment umfaÿt also im wesentlichen die freien Parameter
; a
= z, wodurch die lineare Transformation für das
Ali-gnmentdie folgendeGestalt annimmt:
T
2.3. Das Pattering
Sollte esnichtmöglichsein,diegewünschteAuösungdes
Digitali-sierungsprozesses mitderAufnahmevergröÿerungderartabzustimmen,
daÿ eine Aufnahme pro Ultradünnschnitt ausreicht, so ermöglicht es
der PatternModus, mehr als ein Bild in eine Schnittebene zu
über-nehmen. Diese Bilder werden dann in eine bestehende Ebene derart
integriert,daÿ dasGesamtbilddes Ultradünnschnittesdurchdie
Über-E e
S s Unterebenen Konturen
T i Bild
Abbildung 2.3.1. Jede Ebene beherbergt einen
Un-terebenenknoten, der die Bilddaten aufnimmt, sowie
einen Konturknoten, der die Umrandungen der
Objek-te, d.h. die Konturen verwaltet. Beiden Knoten ist die
Transformation S
s
vorausgeschaltet, die die V
erzerrun-gen in der Ebene korrigiert. Jeder Unterebenenknoten
kannmehrereBildknotenverwalten (U
1 bisU
l
),indenen
jeweils die Bildgröÿe T
size
als auch die
Bildtransforma-tionen T
i
abgelegtsind.
Esistwichtig,beidenAufnahmendaraufzuachten, daÿdie
Einzel-bilder mitÜberlappung aufgenommen werden. Nur so ist man in der
Lage, die Einzelbilder erfolgreich zu einem Gesamtbild
zusammenzu-setzen (siehe Abbildung (2.3.2)). Prinzipiell gilt: Je gröÿer die
Über-lappung, je genauer ist die exakte relative Lage der Einzelbilder
zu-einander zu bestimmen. Wie wir der schematischen Darstellung in
2.3.1 entnehmen können, werdendieTransformationenisoliertund
ge-zielt auf die Einzelbilder angewandt, da diese unterhalb eines
spezi-ellen Group-Knotens, dem sog. Separator (Trenner) organisiert sind.
DieTransformationdes EinzelbildesmitdemfortlaufendenIndexihat
demnach dieGestalt:
T
Wir haben in dieser linearen Transformation die Variable m
i
ein-geführt. Sie soll der Tatsache Rechnung tragen, daÿ das EM bei der
Aufnahme leichten Vergröÿerungsschwankungen unterliegt. Dies gilt
U 1
U 2
U 1
U 2
Abbildung 2.3.2. Links sind zwei Bilder dargestellt,
bei denen der Überlappungsbereich ungenügend groÿ
erscheint, um ein gutes Pattering vornehmen zu
kön-nen. Rechts hingegen ist der Überlappungsbereich
aus-reichend groÿ.
bei der Aufnahme erhitzt und sich dadurch ausdehnen kann.
Beson-ders auällig ist es, daÿ v.a. Sekundäraufnahmen, die einen gewissen
ZeitraumnachdenPrimäraufnahmengemachtwurden,
Vergröÿerungs-änderungenaufweisen. NurdurchdieEinführungdesSkalierungs-oder
Vergröÿerungsparametersm
i
kannesgelingen,dieseAufnahmenin
aus-reichender Genauigkeitin das bestehende Mosaikeinzufügen.
2.4. Das Squeezing
DieserModuswurdeinCARintegriert,umdieunterschiedlichen
De-formationen, die das Gewebe beimDünnstschneiden durch das
Ultra-mikrotomerfährt,rückgängigzu machenundzu korrigieren,wasdurch
ApplikationvonXyloldampf(siehe[Rei67])nurunzureichend
bewerk-stelligt werden kann 5
. Esist aufjeden Fallnicht zu erwarten, daÿ alle
SchnittegleichstarkeVerformungenerfahren. Daher wirdversucht,der
ungleichmäÿigenVerformung desSchnittesdurchdieApplikationeiner
Skalierungsmatrix Rechnung zu tragen. Diese Matrixhat die Gestalt:
S
Auch hier werden die Skalierungsfaktoren s
x
und s
y
relativ von
einer Ebene E
n
zu vorhergehenden Ebene E
n 1
justiert,was dieschon
imAbschnitt 2.2 aufSeite28 angesprochenenpraktischen Vorteilemit
sichbringt. MankannsichalsoauchhieraufdieRelativtransformation
von der Ebene E
n
zu vorhergehenden Ebene E
n 1
konzentrieren, was
eine Nachkorrektur der Transformationsparametererleichtert.
5
esscheintsogarsozu sein,daÿ sich dieSchnittenach demBedampfen