Wert der absoluten STD-Prozente auf 100 % normiert, um die relativen STD-Prozente zu erhalten.
Da in einigen Fällen eine eindeutige Zuordnung der Ligandsignale mit 1D-STD-NMR-Spektren nicht möglich war, wurden zweidimensionale STD-HSQC-NMR-1D-STD-NMR-Spektren aufge-nommen. Dazu wurde eine Ligandprobe (v3ct21) mit einer Konzentration von 690 µM in LUV-EDTA-NMR-Puffer hergestellt. Es wurde ebenfalls eine Probe mit einer Rezeptor-konzentration von 5 µM und einer LigandRezeptor-konzentration von 690 µM hergestellt.
Von der Ligandprobe wurde ein phasensensitives, breitbandentkoppeltes HSQC-Spektrum mit der Pulssequenz hsqcedetgpsisp.2 aufgenommen (700 MHz, 285 K). Es wurden 138 Hz für die C-H-Kopplungskonstante gewählt. Die spektrale Breite in F1 betrug 170 ppm und in F2 10 ppm. Die Anzahl der Datenpunkte pro Inkrement betrug 1024 bei 128 Inkrementen. Die Scanzahl betrug 768.
Die Messungen ergaben, dass die gewählte Ligandkonzentration zu niedrig war. Bei höheren Ligandkonzentrationen konnte allerdings keine stabile ligandhaltige Liposomenprobe hergestellt werden, da die Liposomen nach etwa 30 Minuten aggregierten und sedimentierten.
Daher wurden in die Auswertung ausschließlich die Signale einbezogen, deren Zuordnung in den 1D-STD-NMR-Spektren eindeutig möglich war (Kapitel 4.6.2).
Die Negativkontrolle wurde mit Parentalliposomen, die keinen CCR5-Rezeptor trugen, und dem Peptid v3ct21 durchgeführt. Es wurde eine Parentalliposomenkonzentration gewählt, die bei Anwesenheit von CCR5 einer Rezeptorkonzentration von 0.5 µM entsprechen würde. Die maximale Ligandkonzentration betrug 333 µM. Der höchste Ligandüberschuss war 666-fach.
160 Experimenteller Teil einer frisch angesetzten Lösung aus EDC (0.2 M) und NHS (0.05 M) über eine Kontaktzeit von 10 Minuten bei einer Flussrate von 30 µL/min aktiviert. Danach wurde das Peptid immobilisiert, indem die jeweilige Stammlösung 1:1 mit einem 10 mM Acetatpuffer (pH 4.0) versetzt wurde und über eine Kontaktzeit von sechs Minuten bei einer Flussrate von 15 µL/min durch eine Flusszelle der Chipoberfläche geleitet wurde. Die Immobilisierung wurde solange wiederholt bis eine entsprechende Zunahme der RU-Werte eine zufriedenstellende Belegung anzeigte (~ 250 fmol). Nichtumgesetzte Carboxylfunktionen wurden abschließend mit Ethanolamin-HCl (1 M, pH 8.5) blockiert (8 min, Flussrate 30 µL/min).
In Tabelle 29 sind die Belegungen der einzelnen Messchips aufgeführt. Da die Immobi-lisierung nicht gleichmäßig gelang, wurden die RU-Werte der Belegung auf 100 fmol normiert, um eine Vergleichbarkeit der Messwerte zu vereinfachen. Die ermittelten Werte für RUmax wurden für die KD-Wert-Bestimmung ebenfalls entsprechend normiert.
Tabelle 29: Absolute und auf 100 fmol normierte Belegung der Sensorchip-Flusszellen mit den Peptiden.
Peptid Belegung [RU] Belegung [fmol] auf 100 fmol normierte Belegung [RU]
v3cong 327 185 176
v3ct15 490 272 158
v3ct21 2160 981 67
v3o 136 128 106
v3og 364 115 317
Die Aufnahme der Messreihen mit HOS-Zellen erfolgte, indem eine Verdünnungsreihe der Zellen in PBS-Puffer mit den Konzentrationen 36, 360, 900, 1800 und 3600 Zellen/µL erstellt wurde. Die Zelllösungen wurden vor jeder Messung suspendiert und anschließend über eine Kontaktzeit von zwölf Minuten bei einer Flussrate von 15 µL/min über die Chipoberfläche geleitet. Die Messungen wurden zunächst mit aufsteigenden Zellkonzentrationen durchgeführt. Bei späteren Messungen wurden die Konzentrationen zufällig gewählt. Nach dem Ende der Injektionen wurde mindestens zwei Minuten gewartet, bevor die vollständige Dissoziation der Zellen von der Chipoberfläche je nach Zellkonzentration durch ein- bis vierminütige Regenerationspulse mit SDS (1.7 mM) herbeigeführt wurde.
Die Negativkontrolle wurde, wie oben beschrieben, mit dem Glycopeptid v3og und HOS-Parentalzellen durchgeführt.
8 Sicherheitshinweise und Toxikologie
Gefahrensymbole nach GHS
Codierung Gefahrenbezeichnung Piktogramm Beschreibung Signalwort
GHS01 Explosionsgefährlich Explodierende Bombe Gefahr
GHS02 Hochentzündlich;
leichtentzündlich Flamme Gefahr
GHS03 Brandfördernd Flamme über einem Kreis Gefahr
GHS04 - Gasflasche Achtung
GHS05 Ätzend Ätzwirkung Achtung/Gefahr
GHS06 Sehr giftig; giftig Totenkopf mit gekreuzten Knochen Gefahr
GHS07 - dickes Ausrufezeichensymbol Gefahr
GHS08 - Gesundheitsgefahr Gefahr
GHS09 Umweltgefährlich Umwelt Achtung/Gefahr
Substanzname Codierung
nach GHS
Signalwort H-Sätze P-Sätze
Aceton GHS02
GHS07 Gefahr 225, 319, 336 EUH066
210, 233, 240, 241, 242, 243, 264, 280, 303+361+353,
305+351+338, 337+313, 370+378, 403+235, 501
Acetonitril GHS02
GHS07 Gefahr 225, 302, 312, 319, 332
210, 233, 240, 241, 242, 243, 261, 264, 280, 301+312, 302+352, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 322, 330,
337+313, 370+378, 403+235, 501
Ammoniumcarbamat GHS07 Achtung 302 264, 301+312, 330, 501
Ammoniumhydrogencarbonat GHS07 Achtung 302 264, 301+312, 330, 501 Antipain Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
O-(Benzotriazol-1-yl)-
N,N,N',N'-tetra-methyluroniumtetrafluoroborat
GHS07 Achtung 315, 319, 335
261, 264, 280, 302+352, 304+340, 305+351+338, 312, 321, 332+313, 337+313, 362, 403+233, 405, 501
Bio-Gel P-2, 200 - 400 mesh Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Chitin Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Chitinase (EC 3.2.1.14) Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
162 Sicherheitshinweise
Substanzname Codierung
nach GHS
Signalwort H-Sätze P-Sätze
Chloroform GHS07
GHS08 Achtung 302, 315, 350, 373
201, 202, 260, 264, 280, 281, 301+312, 302+352, 308+313, 321, 330, 332+313, 362, 405, 501 Deuteriumoxid Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Dichlormethan GHS08 Achtung 351 201, 202, 281, 308+313, 405, 501
Diethylether GHS02
GHS07 Gefahr
224, 302, 336, EUH019, EUH066
210, 233, 240, 241, 242, 243, 264, 280, 301+312, 303+361+353, 330, 370+378, 403+235, 501
N,N-Diisopropylethylamin
GHS02 GHS05 GHS07
Gefahr 225, 301, 314, 412
210, 233, 240, 241, 242, 243, 260, 264, 273, 280, 301+312,
301+330+331,303+361+353, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 370+378, 403+235, 405, 501
2,5-Dihydroxybenzoesäure GHS07 Achtung 315, 319, 335
261, 264, 280, 302+352, 304+340, 305+351+338, 312, 321, 332+313, 337+313, 362, 403+233, 405, 501
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethyl-carbodiimidhydrochlorid
GHS05
GHS07 Gefahr 315, 318, 335
261, 264, 280, 302+352, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 332+313, 362, 403+233, 405, 501
N,N-Dimethylformamid GHS07
GHS08 Gefahr 312, 319, 332, 360D
201, 202, 261, 264, 280, 281, 302+352, 304+340,
305+351+338, 308+313, 312, 322, 373+313, 363, 405, 501 N,N-Dimethylsulfoxid-d6 Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Essigsäure (100%) GHS02
GHS05 Gefahr 226, 314
210, 233, 240, 241, 242, 243, 260, 264, 280, 301+330+331,
303+361+353, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 370+378, 403+235, 405, 501
Essigsäureanhydrid
GHS02 GHS05 GHS07
Gefahr 226, 302, 314, 332
210, 233, 240, 241, 242, 243, 260, 264, 280, 301+312,
301+330+313, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 370+378, 403+235, 405, 501 ES Tuning Mix Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Ethanol GHS02 Gefahr 225
210, 233, 240, 241, 242, 243, 280, 303+361+353, 370+378,
403+235, 501
Ethanolamin-HCl GHS05
GHS07 Gefahr 302, 312, 314, 332
260, 264, 280, 301+312, 301+330+331, 302+352, 303+361+353, 304+340,
305+351+338, 310, 321, 405, 501
Substanzname Codierung nach GHS
Signalwort H-Sätze P-Sätze
Ethylacetat GHS02
GHS07 Gefahr EUH066, 225,
319, 336
210, 233, 240, 241, 242, 243, 264, 280, 303+361+353,
305+351+338, 337+313, 370+378, 403+235, 501
Ethylendiamintetraacetat-d16 GHS07 Achtung 319 264, 280, 305+351+338, 337+313
Ferulasäure GHS07 Achtung 315, 319, 335
361, 264, 280, 302+352, 304+340, 305+351+338, 312, 321, 332+313, 337+313, 362, 403+233, 405, 501
Fötales Kälberserum Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Fmoc-Aminosäurederivate Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Fmoc-Rink-Amid-Harz Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Fmoc-Rink-Amid-AM-Harz Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Hydrazinhydrat-Monohydrat
GHS02 GHS05 GHS06 GHS08 GHS09
Gefahr
226, 301, 311, 314, 317, 331, 350, 410
201, 202, 210, 240, 241, 242, 243, 260, 264, 273, 280, 281,
301+310, 301+330+331, 302+352, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 308+313, 321, 333+313, 370+378, 391, 403+233, 403+233, 405, 501 N-Hydroxysuccinimid Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Kaliumchlorid Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Kaliumdihydrogenphosphat Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Leupeptin Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
2-Mercaptoethanol
GHS05 GHS06 GHS09
Gefahr 302, 311, 314, 332, 411
260, 264, 273, 280, 301+312, 301+330+331, 302+352, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 390, 405, 501
Methanol
GHS02 GHS06 GHS08
Gefahr 225, 301, 311, 331, 370
210, 240, 241, 242, 243, 260, 264, 280, 301+310, 302+352,
303+361+353, 304+340, 321, 330, 370+378, 403+233, 403+235, 405, 501
Natrium GHS02
GHS05
Gefahr
EUH014, 260, 314
223, 231+232, 260, 264, 280, 301+330+331, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 335+334, 370+378, 402+404, 405, 501 Natriumacetat Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Natriumazid GHS06
GHS09 Gefahr EUH032, 300,
410
264, 273, 301+310, 321, 330, 391, 405, 501
Natriumchlorid Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
164 Sicherheitshinweise
Substanzname Codierung
nach GHS
Signalwort H-Sätze P-Sätze
Natriumdodecylsulfat GHS02
GHS07 Achtung 302, 312, 315, 319, 335
261, 264, 280, 301+312, 302+352, 304+340, 305+351+338, 321, 330, 332+313, 337+313, 362, 403+233, 405, 501 Natriumhydrogencarbonat Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Natriumhydroxid GHS05 Gefahr 314
260, 264, 280, 301+330+331, 303+361+353, 304+340,
305+351+383, 310, 321, 405, 501 Natriumsulfat Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Dinatriumhydrogenphosphat-Monohydrat Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG Neomycin Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Pefabloc GHS05 Gefahr 314
260, 264, 280, 301+330+331, 303+361+353, 304+340,
305+351+338, 310, 321, 405, 501 Penicillin Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Pepstatin Kein gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Piperidin
GHS02 GHS05 GHS06
Gefahr 225, 311, 314, 331
210, 240, 241, 242, 243, 260, 264, 280, 301+330+331, 302+352, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 370+378, 403+233, 403+235, 405, 501
Puromycin Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Pyridin GHS02
GHS07 Gefahr 225, 302, 312, 332
210, 233,240, 241, 242 ,243, 260, 264, 280, 301+312, 302+352, 303+361+353, 304+340, 322, 330, 370+378, 403+235, 501 RPMI-Medium 1640 Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Salzsäure (37 %) GHS05
GHS07 Gefahr 314, 335
260, 264, 280, 301+330+331, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 310, 321, 403+233, 405, 501
Schwefelsäure (95-97 %) GHS05 Gefahr 314
260, 264, 280, 301+330+331, 303+361+353, 304+340,
305+351+338, 310, 321, 405, 501 Streptomycin Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
2,2‘-Dithiobis(5-nitropyridin) GHS07 Achtung 315, 319, 335
261, 264, 280, 302+352, 304+340, 305+351+338, 312, 321, 332+313, 337+313, 362, 403+233, 405, 501
Substanzname Codierung nach GHS
Signalwort H-Sätze P-Sätze
Toluol
GHS02 GHS07 GHS08
Gefahr
225, 304, 315, 336, 361D, 373
201, 201, 210, 233, 240, 241, 242, 243, 260, 264, 280, 281,
301+310, 302+352,
303+361+353, 308+313, 321, 331, 332+313, 370+378, 403+235, 405, 501
Trifluoressigsäure GHS05
GHS07 Gefahr 314, 332, 412
260, 264, 273, 280,
301+330+331, 303+361+353, 304+340, 305+351+338 310, 321, 405, 501
Triisopropylsilan GHS02
GHS07 Achtung 226, 315, 319, 335
210, 240, 241, 242, 243, 261, 264, 280, 302+352, 303+361+353, 304+340, 305+351+338, 312, 321, 332+313, 337+313, 370+378, 403+233, 403+235, 405, 501
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-11
GHS07 Achtung 315, 319, 335
261, 264, 280, 302+352, 304+340, 305+351+338, 312, 321, 332+313, 337+313, 362, 403+233, 405, 501
Trypanblau GHS08 Gefahr 350 201, 202, 281, 308+313, 405, 501
Trypsin-EDTA Unbekannte Gefährdung im Sinne der Richtlinie 67/548/EWG
Auflistung der verwendeten KMR-Substanzen, GHS Kat. 1A und 1B
CAS-Nr. Stoffname Kategorie Verfahren und eingesetzte Menge
Anzahl der Experimente
68-12-2 N,N-Dimethylformamid 1B Peptidsynthese, 90 L 15
7803-57-8 Hydrazinhydrat-Monohydr. 1B Peptidsynthese, 5 mL 15
72-57-1 Trypanblau 1B Zellkultur, 1 mL 25
166 Literaturverzeichnis
9 Literaturverzeichnis
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