Cyclisierung der Peptide und Glycopeptide

56 Ergebnisse und Diskussion

Die Kontrolle des Syntheseerfolgs erfolgte direkt aus der Cyclisierungslösung. Hierfür wurde eine Probe entnommen und per MALDI-TOF-MS analysiert (AAV9). Da der Nachweis auf diesem Weg nicht zufriedenstellend möglich war, wurden die Proben unter dem Einsatz von ZipTipC18-Pipettenspitzen entsalzt und direkt auf den MALDI-Probenträger aufgebracht. Auf diesem Weg konnte zunächst die Anwesenheit des Glycopeptids v3cg nachgewiesen werden. Der Nachweis des analogen Peptids v3c konnte nicht erbracht werden.

Nach dem Entsalzen und Einengen mittels Ultrafiltration (AAV6) gelang weder der Nachweis der Verbindung v3c noch der erneute Nachweis der Verbindung v3cg. Es wurden sowohl das Filtrat als auch der Überstand nach der Ultrafiltration gefriergetrocknet und anschließend massenspektrometrisch überprüft, um auszuschließen, dass die Ausschlussgröße der Filtrationsmembran zu groß gewählt wurde. Es kann keine definitive Aussage getroffen werden, ob die Cyclisierungsreaktion erfolglos war, oder ob sich die gewünschten Produkte lediglich massenspektrometrisch nicht nachweisen ließen.

Das jeweilige Rohproduktgemisch der Peptide v3c und v3cg wurde über eine semipräparative RP-analoge Säule getrennt und die einzelnen Fraktionen per MALDI-TOF-MS analysiert. Ein Nachweis des Peptids v3c sowie ein erneuter Nachweis des Glycopeptids v3cg waren auf diesem Weg nicht möglich.

Daher erfolgte nach AAV10 die Analyse der Rohprodukte mittels ESI-MS. Dazu wurde zunächst eine säulenchromatografische Trennung des Rohgemischs durchgeführt und die einzelnen Fraktionen direkt im ESI-MS-Analysator vermessen. Die massenspektrometrischen Untersuchungen wurden im Positiv- und im Negativ-Ionen-Modus durchgeführt. Auch auf diesem Weg gelang der Nachweis der Produkte nicht.

Da der Nachweis des Glycopeptids v3cg zu Beginn der Cyclisierungsreaktion gelang, ein erneuter Nachweis zu einem späteren Zeitpunkt jedoch nicht mehr erbracht werden konnte, kann vermutet werden, dass bereits gebildete Disulfidbrücken wieder gespalten wurden und eine anschließende Polymerisation begünstigt wurde. In der basischen NH4HCO3-Lösung kann es zu einer Deprotonierung der schwach sauren Thiolgruppen kommen, die wiederum die disulfidverbrückten Peptide nucleophil angreifen und die Cystinbindung spalten können.

Abhilfe könnte hier das Arbeiten in einer schwach basischen bis neutralen Lösung mit dem anschließenden Abbruch der Reaktion durch Ansäuern auf einen schwach sauren pH-Wert (~ 6.8) schaffen. Ebenfalls sinnvoll könnte der Einsatz von Iodacetamid sein, um nichtumgesetzte SH-Gruppen zu cappen.

58 Ergebnisse und Diskussion Fraglich bleibt allerdings, weshalb der Nachweis der nichtcyclisierten Peptide misslang.

Eventuell gehen offenkettige Moleküle sofort und irreversibel die beobachtete Polymeri-sationsreaktion ein und werden somit nach und nach aus der Lösung entfernt. Auch kann eine schlechte Ionisierbarkeit der eventuell nicht vollständig salzfreien Proben zur ungenügenden Detektierbarkeit mittels massenspektrometrischer Methoden führen.

4.2.3.2 Cyclisierung an der festen Phase (v3c37)

Die Cyclisierung der V3-Peptide in Lösung (Kapitel 4.2.3.1) brachte auch nach mehrfacher Durchführung nicht den gewünschten Erfolg. Es kam dabei immer wieder zu unerwünschten Polymerisationsreaktionen.

Daher wurde eine Variante getestet, bei der das Peptid während der Cyclisierungsreaktion am polymeren Träger gebunden blieb.^[226] Hierfür wurde ein Harz mit einer niedrigen Belegung eingesetzt (0.17 mmol/g) und Ansatzgrößen von 25 µmol gewählt. Dadurch sollte zum einen die Bildung von intermolekularen Disulfidbrücken verhindert, zum anderen eine Aggregation der Peptidketten am Harz vermieden werden, die die Tendenz zur Cyclisierung verschlechtert. Um die Wechselwirkungen mit dem polymeren Träger zu reduzieren, wurde das Peptid C-terminal um zwei Aminosäuren der GP120-Sequenz verlängert.

Das Peptid v3c37 wurde unter Standardbedingungen am Harz synthetisiert (AAV1). Die beiden Cysteine, die im Anschluss disulfidverbrückt werden sollten, wurden mit unterschiedlichen Schutzgruppen der Thiole eingesetzt. Ein Cystein trug eine 4-Methoxytrityl (Mmt)-Schutzgruppe, das andere eine S-tert-Butyl-Schutzgruppe. Beide Schutzgruppen konnten somit jeweils selektiv abgespalten werden (Abbildung 22).

Der apparative Aufwand ist deutlich geringer und es entfällt die Notwendigkeit, unter sorgfältigem Sauerstoffausschluss arbeiten zu müssen. Zudem kann der Fortschritt der Cyclisierungsreaktion photometrisch verfolgt werden. Einen Nachteil stellt der kosteninten-sive Einsatz von z. T. giftigen Chemikalien, wie z. B. 2-Mercaptoethanol, dar.

Abbildung 22: Schematische Darstellung der Knüpfung einer Disulfidbrücke eines Peptids am polymeren Träger.

Das S-tert-Butyl-geschützte Cystein wird mit 2-Mercaptoethanol (30 % in DMF) entschützt (1) und anschließend mit 2,2‘-Dithiobis(5-nitropyridin) (DTNP) aktiviert (2). Die 4-Methoxytrityl-Schutzgruppe wird mit TFA (1 % in DCM) entschützt und greift nucleophil den aktivierten Schwefel unter Bildung einer Disulfidbrücke an (3). Im Anschluss folgen die N-terminale Fmoc-Entschützung (4) sowie die Abspaltung des Peptids vom Harz unter gleichzeitiger Entschützung der übrigen Seitenkettenschutzgruppen unter Standardbedingungen (5).

60 Ergebnisse und Diskussion Bei der ersten Durchführung der Synthese wurde das Harz zur Entschützung des S-tert-Butyl-geschützten Cysteins in einer Glasfritte für drei Stunden mit 2-Mercaptoethanol (30 % in DMF) bedeckt und geschüttelt. Nach einem Waschschritt mit DCM wurde 2,2‘-Dithiobis(5-nitropyridin) (DTNP) in Dichlormethan für 80 Minuten auf das Harz gegeben. Dadurch wird die Elektrophilie des Schwefels dieses Cysteins erhöht. Die 4-Methoxytrityl-Schutzgruppe wurde unter schwach sauren Bedingungen (1 % TFA in DCM) entfernt. Die freie Thiolgruppe konnte im nächsten Schritt nucleophil den aktivierten Schwefel des zweiten Cysteins unter Bildung einer Disulfidbrücke angreifen. Die Abspaltung des Nitropyridinderivates ermöglichte eine photometrische Reaktionsverfolgung bei einer Wellenlänge von 386 nm. Die Cyclisierungsreaktion wurde solange durchgeführt, bis der gemessene Wert der Absorption konstant blieb. In diesem Fall erfolgte die Cyclisierungs-reaktion über einen Zeitraum von 95 Minuten.

Im Anschluss folgten die N-terminale Fmoc-Entschützung (AAV2) zur Abschätzung der Kupplungsausbeute sowie die Abspaltung des Peptids vom Harz unter gleichzeitiger Entschützung der übrigen Seitenkettenschutzgruppen (AAV4) unter Standardbedingungen.

Nach einer Reinigung mittels Etherfällung (AAV7) wurde eine Rohausbeute von 12 % (12.1 mg, 3.0 µmol) erhalten.

Die Anwesenheit des Produkts mittels massenspektrometrischem Nachweis (AAV9) konnte an diesem Punkt nicht bestätigt werden. In manchen Fällen kann eine chromatografische Trennung der Rohprodukte mit anschließender massenspektrometrischer Analyse der erhaltenen Fraktionen (AAV10) zum Erfolg führen. Dies war hier nicht der Fall.

Da die Cyclisierungsreaktion auf manuellem Weg keinen Erfolg brachte, wurde diese mikrowellenunterstützt durchgeführt.^[308] Dazu wurde der für die Peptidsynthese verwendete Synthesizer eingesetzt und die entsprechenden Syntheseschritte für die Disulfidbrücken-bildung programmiert. Alle Schritte der Cyclisierung wurden mit einer Leistung von 25 W bei 60 °C durchgeführt. Die Entschützung der S-tert-Butyl-Schutzgruppe erfolgte über einen Zeitraum von 20 Minuten. Die Aktivierung der freien Thiolgruppe mit DTNP sowie die anschließende Abspaltung der Mmt-Schutzgruppe wurden über einen Zeitraum von jeweils sieben Minuten durchgeführt. Die Bildung der Disulfidbrücke erfolgte über einen Zeitraum von sechsmal fünf Minuten.

Die mikrowellenunterstützte Variante dieser Reaktion bietet mehrere Vorteile. Zum einen sank der Zeitaufwand gegenüber der manuellen Durchführung von ungefähr sechs Stunden auf weniger als eineinhalb Stunden. Zum anderen war die Durchführung der Cyclisierung auf

diesem Weg vollautomatisiert möglich. Ein Nachteil besteht darin, dass der Reaktions-fortschritt in diesem Fall nicht photometrisch verfolgt werden konnte.

Die N-terminale Fmoc-Entschützung (AAV2) zur Abschätzung der Kupplungsausbeute sowie die Abspaltung des Peptids vom Harz unter gleichzeitiger Entschützung der übrigen Seitenkettenschutzgruppen (AAV4) erfolgten manuell unter Standardbedingungen.

Nach einer Reinigung mittels Etherfällung (AAV7) wurde das Peptid v3c37 mit einer Rohausbeute von 24 % (24.5 mg, 6.0 µmol) erhalten. Diese war damit doppelt so hoch wie die Rohausbeute, die mit der manuellen Cyclisierung erzielt wurde.

Die Anwesenheit des Produkts mittels massenspektrometrischem Nachweis (AAV9) konnte nicht bestätigt werden. Auch eine chromatografische Trennung der Rohprodukte mit anschließender massenspektrometrischer Analyse der erhaltenen Fraktionen (AAV10) führte nicht zum gewünschten Erfolg. Es konnten lediglich Abbruchpeptide nachgewiesen werden.

Da die Bestimmung des Methylenfluorens Rohausbeuten zwischen 12 und 24 % ergaben, kann davon ausgegangen werden, dass die Synthese der kompletten Peptidsequenz zumindest zum Teil erfolgreich war und beide Cysteine für die Disulfidbrückenbildung vorlagen.

Photometrisch konnte das Spaltprodukt des Nitropyridinderivates bei 386 nm nachgewiesen werden, was die Annahme unterstützt, dass das N-terminale Cystein gekuppelt worden war.

Es konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht geklärt werden, weshalb die Knüpfung einer Disulfidbrücke am polymeren Träger nach Galande et al. bzw. Galanis et al. nicht erfolgreich verlief.^[226,308]