NMR-34 Methoden Experimente kann bereits während der Extrusion ein geeigneter deuterierter Puffer eingesetzt werden, so dass ein zeit- und materialaufwändiger Pufferwechsel entfällt.
Abbildung 15: Messprinzip der SPR-Methode.
Trifft parallel polarisiertes Licht unter Totalreflexion auf die Grenzfläche von zwei unterschiedlich optisch dichten Medien, entsteht im optisch dünneren Medium ein evaneszierendes Feld. Unter bestimmten Einfallswinkeln kommt es zur Anregung von Oberflächenplasmonen einer leitenden Metallschicht an der Grenzfläche. Eine Wechselwirkung der Oberflächenplasmonen mit der evaneszierenden Welle verstärkt das Feld im optisch dünneren Medium. Bei dem Winkel, in dem Totalreflexion auftritt, kommt es zur Intensitätsabschwächung des reflektierten Lichts. Das erhaltene Signal entspricht der Änderung dieses Winkels und wird in response units (RU) angegeben.[282]
Bei dem Winkel, in dem Totalreflexion auftritt, kommt zu einer Intensitätsabschwächung des reflektierten Lichts. Eine Änderung dieses Winkels um 0.1° wird durch eine Änderung des Brechungsindex im optisch dünneren Medium von 1·10-3 hervorgerufen. Zurzeit erhältliche Geräte ermöglichen die Verfolgung von Winkeländerungen von 0.0001°. Das erhaltene Signal entspricht der Änderung des Resonanzwinkels und wird in response units (RU) angegeben. Werden Proteine untersucht, so ist die Änderung des Resonanzsignals nahezu proportional zur Massenzunahme und der Änderung des Brechungsindex in der Nähe der Chipoberfläche.[283] Die Zunahme des Signals von 1 RU entspricht in etwa einer gebundenen Masse von 1 pg/mm2.
Die Goldoberfläche kann für die Immobilisierung des einen Bindungspartners unterschiedlich funktionalisiert werden. Biotinylierte Proteine können z. B. über Streptavidin
36 Methoden und Proteine mit His6-Tag über einen Nickelchelatkomplex gebunden werden. Moleküle, die Thiolgruppen enthalten, können direkt auf der Goldoberfläche immobilisiert werden.[284] Soll ein Bindungspartner mittels Amidkupplung immobilisiert werden, kann dies mithilfe einer carboxymethylierten Dextranschicht geschehen.
Nach der Immobilisierung des einen Bindungspartners wird der zweite in einem geeigneten Puffer durch die Flusszelle geleitet. Tritt ein Bindungsereignis ein, so ändern sich der Resonanzwinkel und damit das SPR-Antwortsignal. Da auch nichtspezifische Bindungs-ereignisse und Einflüsse des Laufpuffers zu einer Änderung der SPR-Antwort führen können, wird parallel zur eigentlichen Messung eine Referenzmessung mit einer Flusszelle durchgeführt, in der kein Bindungspartner immobilisiert wurde.
Die Differenz der Signale der Mess- und der Referenzzelle stellen somit das eigentliche Sensorgramm dar. Abbildung 16 zeigt schematisch den idealisierten Verlauf eines SPR-Experiments.[285]
Abbildung 16: Idealisiertes Sensorgramm einer SPR-Messung.
Das Sensorgramm wird durch die Auftragung der resonance units [RU] gegen die Zeit erhalten. Die Assoziationsphase der Messung beginnt mit der Injektion des mobilen Bindungspartners. Im Idealfall wird innerhalb des Injektionszeitraums ein Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation erreicht (Sättigung). Nach dem Ende der Injektion kommt es zur Dissoziation der Probenmoleküle. Wird keine vollständige Regeneration der Chipoberfläche erreicht, kann dies durch Zugabe von Detergenzien (z. B. SDS) oder Änderung des pH-Werts herbeigeführt werden. Die kinetischen Parameter (kon, koff) können aus dem Kurvenverlauf erhalten werden. Der Wert der thermodynamischen Dissoziationskonstante KD kann durch die Aufnahme einer Konzentrationsreihe und die Anpassung an ein geeignetes Bindungsmodell erhalten werden.
Erfolgen die Bindungsprozesse nicht zu schnell, lassen sich direkt aus dem Sensorgramm die kinetischen Daten der Assoziation (kon) und der Dissoziation (koff) und damit die thermodynamische Dissoziationskonstante KD bestimmen (Gleichung 4).[286]
[ ] [ ]
[ ] Gleichung 4
Gleichung 4: Berechnung der thermodynamischen Dissoziationskonstante KD.
kon = Assoziationskonstante und koff = Dissoziationskonstante, [A] = Konzentration des immobilisierten Bindungspartners, [B] = Konzentration des Bindungspartners in Lösung, [AB] = Konzentration des Rezeptor-Ligand-Komplexes.
In bestimmten Fällen kann die Bestimmung der Dissoziationskonstante nur über die Aufnahme von Konzentrationsreihen möglich sein.[287,288] So kann es bei den Messungen zu einer Verfälschung der Werte von kon und koff durch Rückbindungseffekte, Massentransport-limitierungen des mobilen Bindungspartners bei hohen Konzentrationen und langsamen Flussraten oder die gerätespezifische Datenrate kommen.[289,290] Der KD-Wert kann dann durch die Anpassung an ein geeignetes Bindungsmodell erhalten werden. Dazu werden die maximalen Werte der SPR-Antwort gegen die Konzentration des mobilen Bindungspartners aufgetragen. Dem one site binding-Modell liegt Gleichung 5 zugrunde.
Gleichung 5
Gleichung 5: KD-Wert-Bestimmung bei SPR-Experimenten durch mathematische Anpassung an das one site binding-Modell.
RU = Gleichgewichtswert der SPR-Antwort bei der Konzentration c, RUmax = Sättigungswert der SPR-Antwort bei unendlich hoher Konzentration des gelösten Liganden, cB = Konzentration des in Lösung befindlichen Bindungspartners, KD = thermodynamische Dissoziationskonstante [mol/L]. Das Ergebnis der Anpassung ist eine Funktion, die direkt die Dissoziationskonstante der Konzentration bei RUmax/2 ergibt.
Moderne SPR-Geräte ermöglichen die Bestimmung von KD-Werten bei unterschiedlichen Temperaturen und dadurch zusätzlich die Ermittlung thermodynamischer Daten der Entropie und Enthalpie.
38 Zielsetzung
3 Zielsetzung der Arbeit
Das HI-Virus befällt Zellen des humanen Immunsystems. Für die Bindung an humane Wirtszellen sind mehrere Interaktiosschritte notwendig. Nach der Bindung an den CD4-Rezeptor kommt es zur Exposition des V3-Loops des viralen GP120. Der V3-Loop tritt in Wechselwirkung mit einem membranständigen Corezeptor aus der Familie der GPCRs (CCR5 oder CXCR4).[119] Im Anschluss kommt es zur Fusion des Virus mit der Wirtszelle.
Da es sich um ein frühes Stadium des HIV-Replikationszyklus handelt, ist die Inhibition des HIV entries ein sehr gut geeigneter Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Wirkstoffe.
Jedoch ist die genaue Interaktion zwischen dem V3-Loop und den Corezeptoren noch weitgehend unbekannt. Teilen der V3-Sequenz sowie der Glycosylstruktur an Position 301 wird eine entscheidende Bedeutung beim HIV entry zugeschrieben.[291] Für ein genaues Verständnis sind daher Untersuchungen auf molekularer und besonders atomarer Ebene unverzichtbar.
Hierfür sollen u. a. Peptide aus dem C-terminalen V3-Bereich, sowie lineare und cyclische Peptide und Glycopeptide, die die gesamte Sequenz des V3-Loops beinhalten, untersucht werden. Als Referenz zu vorangegangenen Studien sollen ein kürzeres Peptid sowie ein Glycopeptid aus dem N-terminalen Bereich des V3-Loops dienen.[274] Glycopeptide sollen an Position 301 das Minimalmotiv eines Komplex-Typ-N-Glycans, die Chitobiose, enthalten.
Das Disaccharid soll zunächst dargestellt und in einer linearen Synthesestrategie in Form eines Chitobiosylasparagin-Bausteins mittels SPPS in die Peptide eingebaut werden. Zwei Stufen der literaturbekannten fünfstufigen Bausteinsynthese sollen dabei optimiert werden.
Die Konformation der Peptide soll mittels CD-Spektroskopie sowie NOESY-NMR-Experimenten analysiert werden. Zur Untersuchung der Interaktion der Peptide und Glycopeptide mit dem CCR5-Corezeptor sollen zwei Methoden, STDD-NMR und SPR, angewendet werden. Dafür werden HOS-Zellen eingesetzt, die den membranständigen Corezeptor überexprimieren. Dieser muss somit für die unterschiedlichen Analysetechniken nicht aus seiner nativen Umgebung entfernt werden. Untersuchungen mittels SPR ermöglichen die Analyse der Kinetik sowie der Affinität der V3-CCR5-Bindung.[275] Mithilfe von STDD-NMR-Studien können zusätzlich detaillierte Bindungsepitope auf atomarer Ebene sowie kinetische Daten erhalten werden.[248]
Die Ergebnisse der Untersuchungen können somit eine wertvolle Grundlage für das Design potenzieller entry-Inhibitoren sein.