Mit der IEF ist es möglich, die Phosphorylierungsunterschiede und Verteilung der Phos-phorylierungsgrade innerhalb der Rhodopsin-Präparationen zu visualisieren. Die einer IEF entsprechenden präparative Methode ist die Chromatofokussierung (Slyterman &
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Wijdenes, 1977, 1978 & 1981; Slyterman & Elgerson, 1978). Da der von der Firma Phar-macia für die Ausbildung des pH-Gradienten entwickelte Puffer (Polypuffer 74) zu Be-ginn der vorliegenden Arbeit aus der Produktion genommen wurde, konnte die Trennung der unterschiedlich phosphorylierten Rhodopsin-Spezies (pRho-Spezies) nicht mehr nach dem in der Literatur beschriebenen Protokoll mittels Chromatofokussierung erfolgen.
Mehrere alternative Puffersysteme wurden untersucht (Shan & Anderson, 2002; Ander-sen et al., 2004; Ahamed et al., 2007; Shen et al., 2008), brachten aber nicht den ge-wünschten Trennungseffekt (Daten nicht gezeigt). Deswegen musste eine alternative säu-lenchromatographische Trennungsmethode etabliert werden. Verwendet wurde ein abge-wandeltes Protokoll von McDowell (McDowell et al., 2000), bei der die phosphorylierten Rhodopsin-Spezies mit einer ursprünglich für die Chromatofokussierung entwickelten Anionenaustauschersäule (MonoP) mittels Salzgradient (0 M bis 1 M NaCl) aufgetrennt wurden. Die einzelnen Auftrennungsläufe werden nachfolgend als RS (für Rhodop-sin-Spezies-Separation) abgekürzt.
Abbildung 18: Rhodopsin-Spezies-Separation von phosphoryliertem Rhodopsin
Rhodopsin-Spezies-Separation (RS)-Elutionsprofile (oben) einer hochphosphorylierten (A) sowie einer mediumphosphorylierten (B) Rhodopsin-Präparation. Die entsprechenden Fraktionen (A bis G) wurden nach Aufbereitung via IEF aufgetrennt (unten). Die Anzahl der Phosphate ist rechts den Banden anhand der IPs zugeordnet (0 P bis 7 P).
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Abbildung 18 zeigt den Vergleich der RS-Läufe von hoch- und mediumphosphoryliertem Rhodopsin als Ausgangsmaterial. Wie im IEF-Gel bereits festgestellt, ist die Konzentra-tion der höheren Phosphatanzahl (4 P bis 7 P) in der Rhodopsin-PräparaKonzentra-tion am höchsten, die während der Phosphorylierung für zwei Stunden belichtet wurde. Die höher phospho-rylierten Rhodopsin-Spezies eluieren ab einer Salzkonzentration von 0,4 M bis etwa 0,8 M. Im IEF-Gel kann der Phosphorylierungsgrad der in den jeweiligen Fraktionen ent-haltenen Rhodopsin-Spezies ermittelt werden. So enthält die Fraktion C (aus Abbildung 18 A) überwiegend vierfach, Fraktion D fünffach, und Fraktion E sechsfach phosphory-liertes Rhodopsin. Die Fraktionen F und G beinhalten eine Mischung aus sechs- und sie-benfach phosphoryliertem Rhodopsin. Verglichen damit weist das Elutionsprofil des RS-Laufes mit mediumphosphorylierter Rhodopsin-Präparation als Ausgangsmaterial ein komplett anderes Elutionsprofil auf. Auch das anschließende IEF-Gel mit den aufberei-teten Elutionsfraktionen (A bis G, aus Abbildung 18 B) zeigt ein anderes Bandenmuster.
Obwohl bei der mediumphosphorylierten Rhodopsin-Präparation auch alle phosphory-lierten Rhodopsin-Spezies vertreten sind (0 P bis 7 P), liegen im Vergleich zur anderen Präparation gerade die niedrig phosphorylierten Spezies (0 P bis 4 P) höher konzentriert vor. Für die Auftrennung spielt auch der pH-Wert eine entscheidende Rolle. Der Einfluss des pH-Wertes auf die Trennung ist auf Seite 148 in Abbildung 46 dargestellt. Ein höherer pH-Wert (pH = 8) führt zur Stauchung des Elutionsprofils, wohingegen ein pH-Wert un-terhalb von 7 (pH = 6) ein breiteres Elutionsprofil bewirkt. Da die einzelnen Rhodopsin-Spezies bei pH = 7 am besten aufgetrennt wurden, wurden alle weiteren Rhodopsinsepa-rationen bei pH = 7 durchgeführt.
Abbildung 19 zeigt, wie unterschiedlich die Verteilung der Rhodopsin-Spezies innerhalb verschiedener pRho-Präparationen ist, obwohl sie unter den gleichen Bedingungen (zwei Stunden Belichtung) durchgeführt wurden. Weitere Rhodopsin-Spezies-Separationsläufe sowie eine Tabelle mit den pRho-Spezies aus allen RS-Läufen sind im Anhang dargestellt (vgl. Abbildung 47 bis Abbildung 49 ab Seite 149; Tabelle 12 bis Tabelle 15 ab Seite 151). Die Nummerierung der einzelnen RS-Läufe lehnt an die ursprüngliche Ver-suchsanzahl an, inklusive sämtlicher Vorversuche, bis die Methode zum quantitiven Auf-trennen der phosphorylierten Rhodopsin-Spezies genutzt werden konnte. RS-Läufe 17 und 19 (Abbildung 19 A & C) zeigen die je Peak vereinten Fraktionen (A bis H bzw. A bis L).
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Abbildung 19: RS-Läufe 17 & 19
(A, C) Elutionsprofile von zwei unterschiedlichen, hochphosphorylierten Rhodopsin-Prä-parationen (RS-Läufe 17 (A) und 19 (C)). Fraktionen (A bis H bzw. A bis L) wurden nach Aufbereitung via IEF aufgetrennt (B, D). Die Anzahl der Phosphate ist rechts den Banden aufgrund der IPs zugeordnet (0 P bis 7 P), sowie zur Verdeutlichung direkt neben dominie-renden Banden gesetzt. Es wurden insgesamt etwa 8 mg pRho aufgetrennt, um mit den phosphorylierten Rhodopsin-Spezies weiterzuarbeiten.
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Obwohl der erste Peak in RS17 (Fraktion ARS17) eine deutliche UV-Absorption aufweist, ist im IEF-Gel kein Rhodopsin nachweisbar. Diese Fraktion enthält vermutlich andere Proteine wie z.B Concanavalin A. Abhängig von den Mengen an unphosphoryliertem Rhodopsin in der Probe enthält der erste Peak auch unphosphoryliertes Rhodopsin, wel-ches nicht an das positiv geladene MonoP-Säulenmaterial bindet (vgl. Abbildung 18 auf Seite 42 & Abbildung 48 auf Seite 149). Da die höher phosphorylierten Rhodopsinproben für weitere Bindungsanalysen eingesetzt wurden, wurden die Fraktionen mit den niedri-geren Phosphorylierungsniveaus nur stichprobenartig untersucht. Mit steigender NaCl-Konzentration steigt die Anzahl der Phosphate in den Rhodopsinproben.So konnten mit RS17 und RS19 pRho-Spezies mit bis zu sieben Phosphatresten aufgereinigt werden, welche in späteren fluoreszenzbasierten Messungen zur Bindung von Arrestin untersucht wurden. Eine Auflistung der aus den IEF-Gelen der RS-Läufe 17, 19 bis 21 und 25 er-mittelten prozentualen Phosphorylierungsverteilung ist in Tabelle 1 aufgeführt. Fraktio-nen, die sehr ähnliche Mischungen an pRho-Spezies beinhalten, wurden für die nachfol-genden Messungen vereinigt, wenngleich leichte Unterschiede in der prozentualen Ver-teilung der Phosphorylierungsanzahlen erkennbar sind. Zur Benennung der jeweiligen Mischungen wurden die enthaltenen pRho-Spezies (ab etwa 5 % Anteil) angegeben, wo-bei die jeweils dominierende Spezies in fettgedruckter Zahl dargestellt ist.
Tabelle 1: Prozentuale Verteilung der Phosphatreste innerhalb der pRho-Speziesa 3/4/5-P
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a mit der Software „GelQuant“ unter Verwendung der dargestellten IEF-Gele zu den jeweiligen RS-Läufen be-stimmt (siehe auch Abbildung 19 auf Seite 44, Abbildung 47 bis Abbildung 49 ab Seite 149).
b Das IEF-Gel zeigt keine klare Bande, weshalb die prozentuale Verteilung nur eine Schätzung darstellt.
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