Die isoelektrische Fokussierung (IEF) ermöglicht eine quantitative Analyse der Phospho-rylierungsverteilung innerhalb der Rezeptorproben. Die IEF-Methode wurde bereits mehrfach für die Analyse der Rhodopsinphosphorylierung verwendet (u.a. in Adamus et al., 1988; McDowell et al., 1993; Adamus et al., 1993; McDowell et al., 2000). Die Me-thode musste jedoch aufgrund von technischen Änderungen der bei der IEF genutzten Gele und Materialien für diese Arbeit zunächst neu etabliert werden. Es stellte sich her-aus, dass der Schlüssel zur IEF-Auftrennung in der vollständigen Delipidisierung des Rhodopsins liegt, welche abhängig vom verwendeten Detergens ist und über einen Zwi-schenschritt mit OG erreicht werden kann. Die einzelnen Banden in den IEF-Gelen zeigen die in der Präparation vorhandenen pRho-Spezies. Die Trennung erfolgt hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Phosphorylierungsanzahl und kann anhand des sinkenden isoelektri-schen Punkts (IP) den bis zu sieben Phosphorylierungen zusätzlich zum unphosphorylier-ten Rezeptor zugeordnet werden. Die Zuordnung der Banden passt zu den veröffentlich-ten Werveröffentlich-ten (McDowell et al., 1993; 2000; vlg. Tabelle 5 auf Seite 80).
Die in der Literatur beschriebenen IEF-Auftrennungen beschränken sich meist auf null bis fünf Phosphate (Adamus et al., 1988; McDowell et al., 1993; Adamus et al., 1993;
McDowell et al., 2000). Zusätzlich konnten in dieser Arbeit auch die pRho-Spezies mit sechs sowie mit sieben Phosphaten aufgetrennt werden. Über Western-Blot sowie en-zymatischer Dephosphorylierung der zuvor phosphorylierten Rhodopsinproben war es
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möglich, das Trennergebnis der IEF zu bestätigen (siehe auch Abbildung 16 und Abbil-dung 17 auf den Seiten 39 bis 41) und zu zeigen, dass die unterschiedlichen Banden im IEF-Gel, die im Bereich des IPs von 6,0 bis 4,0 auftreten, tatsächlich die einzelnen pRho-Spezies abbilden und somit dem oben beschriebenen Phosphorylierungsgrad der Rezeptorprobe zugeordnet werden können.
Tabelle 5: IP-Zuordnungen der pRho-Spezies
Phosphatanzahl Eigene IP-Wertea IP-Werte der Literaturc 0 P
a Die IP-Zuordnung erfolgte über die Bandenverteilung des Standards und stellt einen Durchschnitt der IP-Werte aller durchgeführten IEFs dar; die Auftrennung kann geringfügig schwanken, je nachdem, welcher Ampholytmix zum Äquilibrieren des IEF-Gels genutzt wurde (d.h. IP 3 bis 7 oder IP 4 bis 7) und wie die Elektrodendochte auf dem Gel platziert wurden.
b Nebenbande < 1 %
c McDowell et al.,1993: 0 P bis 4 P d McDowell et al., 2000: 0 P bis 5 P
0 P-Rhodopsin hat eine Hauptbande bei IP = 6,0 und eine schwache Nebenbande im Be-reich von IP ~5,60 bis 5,50. Nach Proteolyse mit Asp-N verlagert sich die Hauptbande in den Bereich von IP ~7,4 bis 6,9 und teilt sich in zwei Banden, welche dem trunkierten Rhodopsin entsprechen, je nachdem, ob nach dem ersten Asp- oder zweiten Asp-Rest im C-Terminus geschnitten wurde (siehe Abbildung 45 C auf Seite 147). Sämtliche Banden unterhalb von IP = 6,0 verschwinden durch das proteolytische Entfernen des C-Termi-nus‘ des Rezeptors, was zeigt, dass diese Banden nur für Phosphorylierungen innerhalb des Rezeptor-C-Terminus‘ stehen. Die Bandenverteilung der aufgetrennten phosphory-lierten Rezeptorproben zeigt zudem nie mehr als sieben Phosphate, was der Anzahl der potenziellen Phosphorylierungsstellen im bovinen Rezeptor-C-Terminus entspricht. Es
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ist daher davon auszugehen, dass (im Gegensatz zu frühen Veröffentlichungen von Wil-den & Kühn (1982), bei Wil-denen mehr als sieben Phosphorylierungen gefunWil-den wurWil-den) keine Phosphorylierung außerhalb des C-Terminus‘ erfolgt.
Wie zu erwarten, zeigt die IEF von pRho aus unterschiedlichen Präparationen, die sich in der Inkubationszeit mit der endogenen Rhodopsinkinase unterscheiden (vgl. 2.1.1 ab Seite 34), deutliche Unterschiede im Phosphorylierungsgrad (siehe Abbildung 15 auf Seite 38). Eine zehnminütige Belichtungszeit ergibt Rezeptor-Präparationen mit einer Mi-schung aus 0 P bis 4 P, geringfügig sogar bis zu 5 P (mediumP, Abbildung 15). Rhodop-sin-Präparationen, die zwei Stunden (Sättigung) belichtet werden (hochP, Abbildung 15), enthalten dagegen bevorzugt 4 P bis 7 P und nur einen kleinen Anteil gering phosphory-lierter (0 P bis 3 P) Rezeptoren. Allerdings zeigen diese Rezeptorpräparationen trotz glei-cher Belichtungszeit deutliche Schwankungen der Phosphorylierungsverteilung und -menge, insbesondere ab dem fünften Phosphatrest. Diese Schwankungen sind wahr-scheinlich auf den variablen Gehalt an aktiver Rhodopsinkinase in den Präparationen zu-rückzuführen; eine Variabilität der enzymatischen Aktivität könnte z.B. durch die unter-schiedliche Transportdauer des Augenmaterials verursacht werden.
Der variable Phosphorylierungsgrad der hochphosphorylierten Rhodopsin-Präparationen zeigt auch den Vorteil der IEF-Methode gegenüber der funktionellen Charakterisierung über Extra Meta II-Messungen mit Arrestin. Mit letzteren kann nur der prozentuale Anteil nicht bzw. gering phosphorylierter Rezeptoren ermittelt werden, da diese kein Arrestin-1 binden können; Rezeptoren mit mehr als drei Phosphaten können nicht über eine Meta II-Stabilisierung unterschieden werden.
Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist, dass Rhodopsinproben, die nicht nachträglich phosphoryliert werden, dennoch geringe, aber meist signifikante Mengen von ein bis zwei Phosphatresten (siehe Abbildung 15 auf Seite 38) enthalten. Somit wurde gezeigt, dass ursprünglich als „unphosphoryliert“ (nonP) bezeichnete Rhodopsin-Präparationen nicht durchgehend einheitlich unphosphoryliert vorliegen. Dies ist vermutlich darauf zurück-zuführen, dass nach Schlachtung der Kuh und Entnahme der Augen (beide Prozesse lau-fen unter normaler Beleuchtung ab), keine komplette Dunkeladaptation und Dephospho-rylierung beim anschließenden Transport und der Präparation der Retinae im Dunkeln erfolgen konnte. Dieses Ergebnis wirft insbesondere die Frage auf, ob die Behauptung,
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dass Arrestin auch an „unphosphoryliertes“ Rhodopsin bindet, wie es in der Literatur be-reits mehrfach beschrieben wurde (Vishnivetskiy et al., 1999; zusammengefasst in Gure-vich & GureGure-vich, 2004), tatsächlich stimmt. In all diesen Experimenten wurde die Phos-phorylierung ausschließlich mittels radioaktivem ATP quantifiziert, sodass zuvor endo-gen phosphoryliertes Rhodopsin nicht detektiert werden konnte. Eine IEF-Analyse, die auch endogen phosphoryliertes Rhodopsin aufzeigen würde, wurde in diesen Versuchen nicht durchgeführt.