Selektion und Anreicherung von antigenspezifischen Phagen

Die Selektion und Anreicherung von antigenspezifischen Phagen aus einer Phagenbibliothek erfolgte mittels eines in situ, in vitro sowie in vivo „Biopanning´s“. Diese Methode basiert auf einer künstlich eingeleiteten Antigen-Antikörper-Auslese, welche zu derjenigen analog ist, die in einem Säugetier-Immunsystem stattfindet. Das Repertoire scFv-präsentierender M13- Phagen wird hierbei mit einem Antigen inkubiert, gegen das die gewünschte Spezifität gerichtet werden soll. Während dieses Inkubationsvorgangs binden die antigenspezifischen Phagen an die vorgesehenen Epitope und bringen auf diese Weise Phagen-Antigen-Komplexe hervor. Unspezifisch gebundene Phagen werden in folgenden Schritten durch stringentes Waschen entfernt. Die an Antigen-Antikörperbindungsstellen assoziierten, spezifischen Phagen werden durch eine Reinfektion mit TG1 E. coli-Bakterien vom Epitop eluiert und in Bakterienzellen klonal vermehrt. Durch dreimalige Wiederholung jedes einzelnen „Bio-panning“ -Experimentes kann eine erfolgreiche Phagen-Selektion erreicht und eine maximale Anreicherung der spezifischen Antikörperfragmente gewährleistet werden.

2.4.4.1 „Biopanning“ auf Gewebeschnitten von Kollateralarterien und Kontrollgefäßen Die in dieser Arbeit untersuchten Antigene (CTA und VEGFR-2) werden haupt-sächlich auf verschiedenen Kompartimenten der Blutgefäße und diversen Endothelzelllinien exprimiert. Für die erste Selektions- und Anreicherungsrunde spezifisch bindender Phagen wurden Ratten- sowie Humangewebeschnitte von Kollateralarterien und Kontrollgefäßen angefertigt. Geschnittene Rattengefäße wurden auf Objektträgern positioniert (jeweils 2 Schnitte pro Objektträger) und sowohl im nativen als auch im acetonfixierten Zustand für das

„Biopanning“ verwendet. Humane Gefäßproben wurden hingegen formalinfixiert und in Paraffinblöcke eingebettet (siehe 2.6.1). Vor jedem „Biopanning“-Experiment mussten die acetonfixierten Schnitte für 20 min in 1 x PBS-Lösung rehydriert und die Paraffinschnitte mittels einer sogenannten „alkoholischen Reihe“ (siehe 2.6.3) entparaffiniert werden. Die auf diese Weise vorbereiteten Proben wurden dann in eine „befeuchtete Präparat-Kammer“

übertragen und zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen für 1 h bei RT mit Blocking Puffer A (siehe 2.1.7) inkubiert. Nach der Blockierung sind die Objektträger in eine Waschküvette transferiert worden, wo sie 3 x 5 min mit 1 x PBS-Puffer gewaschen wurden.

Während des Waschvorgangs wurde die zu untersuchende, scFv-präsentierende Phagen-bibliothek in einem Reagenzgefäß mit Blocking Puffer A (1:10), Natrium Azid

(Endkonzentration: 0,01% v/v) und Triton X-100 (Endkonzentration: 0,1%) versetzt und in einem Überkopfschüttler (siehe 2.1.10) für 15 min bei RT geblockt. Die in der Zwischenzeit gewaschenen Gefäßproben wurden erneut in die oben erwähnte Kammer überführt, mit jeweils 100 µl der geblockten Phagensuspension (10¹² Phagen/ml) pro Schnitt überschichtet und für 2 h bei 37°C inkubiert. Daraufhin folgte stringentes Waschen der Gefäßschnitte (20 x 5 min mit 1 x PBS-Puffer und 20 x 5 min mit 1 x PBS/0,1% Tween 20-Puffer), infolgedessen die unspezifischen Phagen zum größten Teil entfernt werden konnten.

Für die Elution und Anreicherung von antigenspezifischen Phagen wurden mehrere Falcon-Röhrchen zunächst mit 10 ml 2 x YT-Medium gefüllt, dann mit jeweils 100 µl einer über Nacht gewachsenen TG1-Bakterienkultur angeimpft und unter Schütteln (250 rpm) bis zur OD600 = 0,3-0,4 bei 37°C kultiviert. Danach wurden die bereits gewaschenen Gefäß-schnitte unter sterilen Bedingungen in die Röhrchen mit logarithmisch gewachsenen Bakteriensuspensionen überführt und dort waagerecht für 1 h bei 37°C (150 rpm) inkubiert.

Anschließend wurden alle Objektträger entfernt, die reinfizierten Bakterien schonend sedi-mentiert (5 min bei RT und 3.000 x g) und in 1 ml 2 x YT-Medium aufgenommen.

Zur Selektion wurden jeweils 50-100 µl der Bakterienkulturen auf SOBAG- Agarplatten ausgestrichen und üN bei 30°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die ampicillinresistenten Bakterienklone mit jeweils 1 ml 2 x YT-AG-Medium von den Agar-platten abgelöst und entweder direkt für eine weitere Selektionsrunde eingesetzt oder kryokonserviert. Für eine erfolgreiche Anreicherung von scFv wurden in der Regel drei nacheinander folgende „Biopanning“-Experimente durchgeführt. Die nach der dritten

„Biopanning“-Runde angereicherten Bakterienkolonien wurden mittels Kolonie-PCR, Restriktionsanalysen und Sequenzierungen auf das Vorhandensein von scFv überprüft und an-schließend für die Selektion auf Endothelzellen sowie in vivo -Versuche verwendet. Für alle

„Biopanning“-Experimente sind jeweils 2 Negativkontrollen präpariert worden. Zur Kontrolle des Prozentsatzes an unspezifischen Phagen, die im Verlauf des „Biopanning´s“ trotz des stringenten Waschens angereichert wurden, dienten Gefäßschnitte, die mit einer reinen M13- Phagenpopulation inkubiert wurden, welche definitiv keine Antikörperfragmente auf der Oberfläche präsentierte. Die Überprüfung einer eventuellen bakteriellen sowie pilzlichen Kontamination erfolgte mittels Gefäßproben, die während des Antigen-Antikörper- Inkubationsschrittes anstelle von Phagen mit 1 x PBS-Puffer überschichtet wurden. Beide Kontrollproben sind im Verlauf der Selektion nach dem oben beschriebenen „Biopanning“- Schema behandelt worden.

2.4.4.2 „Biopanning“ auf Endothelzelllinien

Die auf Gefäßchnitten ausselektionierten Phagenpopulationen wurden weiterhin für

„Biopanning“-Experimente auf RHE-A/neg.- und PAE-KDR-11-Zellen (siehe 2.1.2) ein-gesetzt. Dazu wurden diese Endothelzelllinien in vorgegebenen Kulturmedien (siehe 2.1.7) bis zum Erreichen des Subkonfluenzstadiums angezogen (siehe 2.2.2) und unmittelbar vor Beginn jedes „Biopanning“-Experimentes 3 x mit 10 ml 1 x PBS-Puffer gewaschen. Zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wurden die Zellen mit 10 ml Blocking Puffer A überschichtet und für 1 h bei RT inkubiert. Daraufhin folgte dreimaliges Waschen der Zellkulturen mit sterilem 1 x PBS-Puffer. Die zu verwendende, antikörperspezifische Phagensuspension (10¹² Phagen/ml) wurde in der Zwischenzeit mit Blocking Puffer A versetzt und in einem Überkopfschüttler für 15 min bei RT geblockt. Für das „Biopanning“

wurden die bereits gewaschenen Zellen zunächst mit jeweils 10 ml Kulturmedium überschichtet, dann mit 1 ml der vorbereiteten Phagensuspension versetzt und anschließend für 2 h bei 37°C in einem CO2 Inkubator (siehe 2.1.10) inkubiert. Daraufhin folgte stringentes Waschen der Zellkulturen (20 x 10 ml 1 x PBS-Puffer und 20 x 10 ml 1 x PBS/0,1% Tween 20-Puffer), was zur Beseitigung ungebundener Phagen führte. Die antikörperspezifischen Phagen wurden folgend mittels TG1 E. coli-Bakterien von den Endothelzellen eluiert. Dazu wurden die Zellkulturen mit jeweils 10 ml logarithmisch gewachsener Bakteriensuspension (OD600 = 0,3-0.4) inokuliert und für 1 h bei 37°C unter Schütteln (150 rpm) inkubiert. Die Bakterien wurden danach in Falcon-Röhrchen überführt, 5 min bei RT und 3.000 x g sedimentiert und anschließend in 1 ml 2 x YT-Medium resuspendiert. Zur Selektion wurden jeweils 50-100 µl der reinfizierten Bakterienkulturen auf SOBAG-Agar ausplattiert und üN bei 30°C kultiviert. Die am folgenden Tag gewachsenen, ampicillinresistenten Bakterienklone wurden mit jeweils 1 ml 2 x YT-Medium von den Agarplatten abgelöst und entweder für eine weitere Selektionsrunde eingesetzt oder bei -20°C gelagert.

Für alle Untersuchungen an Endothelzelllinien sind jeweils 2 Negativkontrollen nach dem im Kapitel 2.4.4.1 beschriebenen Schema präpariert worden. Nach jedem dritten

„Biopanning“-Experiment erfolgte eine Überprüfung der angereicherten Bakterienkolonien auf die Anwesenheit von scFv mittels Restriktionsanalysen und Sequenzierungen. Antigen-spezifische Bakterienklone wurden dann mit Helferphagen infiziert und in Form von scFv- präsentierenden Phagenpopulationen für in vivo „Biopanning“-Experimente weiter-verwendet.

2.4.4.3 In vivo „Biopanning“

Für die Selektion und Anreicherung antigenspezifischer Phagen in einem in vivo- Modell sind Sprague-Dawley Ratten verwendet worden. Zu diesem Zweck wurde bei den Versuchstieren zunächst die Okklusion einer ihrer Femoralarterien vorgenommen. Bereits 3 Tage nach dem künstlich eingeleiteten Arterienverschluß wurde den Ratten intravasal jeweils 1 ml der zuvor geblockten, scFv-präsentierenden Phagensuspension (10¹² Phagen im Blocking Puffer A) injiziert. Nach 10-minütiger Zirkulation der Phagen im Gefäßsystem wurden die Tiere getötet und deren Kollaterall- sowie Kontrollgefäße herauspräpariert. Die auf diese Weise gewonnenen Gefäßproben wurden folgend in Falcon-Röhrchen mit logarithmisch gewachsenen TG1-Bakterienkulturen (OD600 = 0,3-0,4) überführt und unter Schütteln (150 rpm) für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden alle Gefäßpräparate entfernt, die Bakterienkulturen für 5 min bei RT sowie 3.000 x g sedimentiert und in 1 ml 2 x YT-Medium aufgenommen. Die reinfizierten Bakterien wurden dann auf SOBAG-Agarplatten ausselektioniert und die positiven, ampicillinresistenten Kolonien mittels Restriktionsanalysen und Sequenzierungen auf das Vorhandensein von scFv analysiert.

Antikörperspezifische Klone wurden im weiteren Verlauf der Experimente für die Herstellung und Expression von löslichen scFv eingesetzt.

Die auf Seite 81 präsentierte Abbildung 2.4 stellt eine schematische Zusammen-fassung der in dieser Arbeit angewandten „Phage display“-Technik dar.

AAAA AAAA 2. Immunisierung von Mäusen

mit den Membranpräparationen aus den Kollateralarterien 1. Isolierung von

Kollateral-gefäßen aus einer Ratte, 12 h nach der Ligatur der Femoralarterie

3. Isolierung von B-Lympho-zyten aus der Milz und deren Fusion mit Myelomzellen zu Hybridomazellen

4. Selektion von kollateralspezifischen Hybridomazellen mittels immunhisto-chemischer Färbung auf Schnitten von Kollateralarterien und Kontrollgefäßen AAAA

TTTT

AAAA TTTT 5. RNA-Isolierung aus den Hybridomazellen und cDNA-Synthese

6. PCR-Amplifikation von V_H und V_L und deren Verknüpfung mittels einer Linkersequenz

V_H Linker V_L

7. Restriktionsverdau und Ligation in einen Phagemid-Vektor

V_H V_L 8. Transformation in E. coli

und Verpackung in die M13 K07-Helferphagen

9. Selektion von antigenpositiven Phagen mittels in vivo

„Biopanning“

10. Selektion von antigenpositiven Phagen mittels „Biopanning“ auf Schnitten von Kollateralarterien und Kontrollgefäßen

Abb. 2.4: „Phage display“-Technologie zur Herstellung von antigenspezifischen, rekombinanten Antikörpern; Darstellung der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Strategie