Expression von löslichen scFv in bakteriellen Expressionssystemen Das bakterielle E. coli-Expressionssystem ist in der Vergangenheit mehrfach für die

Generierung von löslichen scFv-Antikörperfragmenten eingesetzt worden (Breitling und Dübel, 1997). Jedoch nicht immer endeten diese Expressionsexperimente mit dem erwünschten Erfolg (Duan und Pomerantz, 1994; Duenas et al., 1995). Auch im Rahmen dieser Arbeit konnten, trotz wiederholter Änderung und Optimierung der Expressions-bedingungen, nur die VEGFR-2-scFv als funktionelle, lösliche Proteine hergestellt werden.

Die kollateralspezifischen scFv-Antikörper wurden hingegen nur in Form von unvoll-ständigen scFv-Fragmenten (ca. 25 kDa) oder einzelnen VL-Domänen (ca. 16 kDa) in den untersuchten E. coli-Extrakten vorgefunden. Es gibt mehrere potentielle Faktoren, die eine erfolgreiche Produktion von löslichen CTA-scFv beeinträchtigt haben könnten. Diese werden im Folgenden ausführlich diskutiert.

4.5.1 Einfluss des Bakterienwachstums sowie einiger Expressionsparameter auf die Produktion löslicher scFv-Antikörperfragmente

Die Expression von Fremdproteinen hat sehr oft einen entscheidenden Einfluss auf das Wachstum des Wirtsorganismus. Durch eine rasche Anhäufung von exprimierten Fremd-proteinen kann in den Wirtszellen eine Stresssituation ausgelöst werden, die zur deutlichen Verlangsamung des gesamten Zellwachstums führt (Eckart und Bussineau, 1996). Als eine sehr häufige Ursache für die Senkung des Wachstumsverhaltens von E. coli-Kulturen wird die Expression von toxischen Proteinen postuliert, welche die Lyse von Bakterienzellen hervorrufen und deren Wachstumsrate dadurch erheblich herabsetzen (Somerville et al., 1994). Bei der Kultivierung von E. coli HB2151-Bakterien für die Produktion von löslichen CTA- sowie VEGFR-2-Antikörperfragmenten konnten, trotz der Verwendung des gleichen Expressionsvektors (pCANTAB 5E), deutliche Wachstumsunterschiede zwischen den beiden gefäßspezifischen scFv-Klonen verzeichnet werden. Bis zur Induktion der Genexpression wiesen die beiden Spezies (s.o.) zunächst ein fast identisches Wachstumsverhalten auf. Nach Zugabe von IPTG (Induktion der Genexpression) konnte bei dem VEGFR-2-scFv-Klon, ähnlich wie bei den HB2151-Kontrollbakterien (ohne scFv-Insert), eine wesentlich stärkere Zunahme der optischen Dichte (schnelles Wachstum) beobachtet werden als bei der CTA-scFv-Spezies. Während die VEGFR-2-exprimierenden E. coli-Bakterien bereits 12-14 h nach

der IPTG-Induktion die stationäre Phase erreichten, gingen die viel langsamer wachsenden CTA-scFv-Kulturen erst 20-22 h nach der Induktion in die stationäre Phase über. Ein ähnliches Phänomen konnte ebenfalls nach der Umklonierung der CTA- sowie VEGFR-2-scFv in den pET15b-Expressionsvektor und der Expression der beiden VEGFR-2- scFv-Antikörper-fragmente im BL21(DE3)-E. coli-Stamm beobachtet werden. Diese auffällige Verlangsamung des Wachstums von CTA-scFv-Bakterienklonen nach der Induktion der Genexpression ist höchstwahrscheinlich auf die Expression der CTA-scFv-Antikörperfragmente zurück-zuführen. Möglicherweise übten die exprimierten, eukaryontischen CTA-scFv-Proteine auf die wachsenden E. coli-Bakterien toxische Effekte aus und führten, durch das Absterben einiger Bakterienzellen, zur deutlichen Senkung deren Wachstumsverhaltens. Eine langsam fortschreitende Zelllyse sowie die Ansammlung von unerwünschten Zellabbauprodukten könnten des Weiteren eine Übersäuerung des verwendeten Kulturmediums hervorgerufen und damit die Produktion sowie Sekretion von korrekt gefalteten, löslichen CTA-scFv-Proteinen stark beeinträchtigt haben.

Aus den Ergebnissen der Western Blot -Experimente ging deutlich hervor, dass die löslichen CTA-scFv-Antikörperfragmente sowohl ins Periplasma als auch in das Kultur-medium in unvollständiger Form und mit sehr geringen Ausbeuten sezerniert wurden.

Möglicherweise hatte die Stärke und Länge der Induktion des lacZ-Promotors einen entscheidenden Einfluss auf die Qualität und Quantität der entstandenen Antikörperfragmente ausgeübt. Eine zu starke Induktion des Promotors (verursacht durch zu hohe IPTG-Konzentrationen) könnte beispielsweise zur Überlastung des bakteriellen Sekretionsapparates führen und das Verhältnis von korrekt gefalteten zu unvollständigen Antikörperfragmenten erheblich zugunsten der Letztgenannten verschieben (Dübel et al., 1992). Eine zu lange IPTG-Induktion würde wiederum (aufgrund der Lyse von Bakterienzellen) zur Freisetzung von proteolytischen Enzymen führen und damit eine mögliche Degradation der frisch sezernierten scFv stark begünstigen. Für die Produktion von löslichen VEGFR-2-spezifischen Antikörperfragmenten konnten die richtigen Induktions- sowie Expressionsparameter erfolgreich festgelegt werden. Die Expression der CTA-scFv bedarf hingegen einer weiteren Optimierung.

Für die Expression toxischer Proteine wurde in der Vergangenheit oft der Einsatz von stark reprimierbaren und chemisch induzierbaren Tetrazyklin-Promotoren vorgeschlagen (Skerra, 1994; Schiweck und Skerra, 1995). Diese zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Expression von rekombinanten Proteinen erst ab dem Zeitpunkt der Induktion zulassen (Breitling und Dübel, 1997). Auf diese Weise können einerseits einige toxische Effekte

ausgeschlossen werden und andererseits kann eine verbesserte Produktion korrekt gefalteter scFv-Proteine erreicht werden. Auch im Bezug auf die Expression der CTA-scFv könnte möglicherweise der Ersatz des bisher verwendeten (mit einem lacZ-Promotor ausgestatten) pCANTAB 5E-Vektors gegen ein anderes, durch Tetrazyklin-Promotor-induzierbares, Expressionssystem zur erfolgreichen Produktion löslicher, kollateralspezifischer Antikörper-fragmente beitragen.

4.5.2 Strukturelle Unterschiede zwischen den CTA- und VEGFR-2-scFv

Anhand vergleichender Sequenz- sowie 3D-Strukturanalysen konnten zwischen den gefäßspezifischen CTA- und VEGFR-2-scFv-Antikörpern deutliche strukturelle Unterschiede registriert werden (siehe 3.6). Diese haben höchstwahrscheinlich im Wesentlichen zu Differenzen im Expressions- sowie Sekretionsverhalten der beiden scFv-Moleküle im E. coli-System beigetragen. Ähnlich wie bei dem VEGFR-2-scFv (Böldicke et a., 2001) konnten auch in den abgeleiteten Konsensussequenzen des CTA-scFv-Antikörpers hochkonservierte Reste und Motive bekannter Immunglobulingene identifiziert werden. Trotz starker Aminosäuredifferenzen wurden dennoch in der CTA-scFv-Sequenz keine auffälligen Mutationen vorgefunden. Diese Befunde führten zu der Annahme, dass das CTA-scFv-Molekül (ähnlich wie der VEGFR-2-scFv-Antikörper) die nötigen Voraussetzungen erfüllt, als funktioneller, löslicher scFv-Antikörper im E. coli-System exprimiert zu werden. Die, im Anschluss an die Expressionsexperimente, durchgeführten Western Blot sowie immunhistochemischen Analysen haben diese Annahme jedoch nicht bestätigt. Wiederholte Bemühungen, vollständige und funktionelle CTA-scFv-Antikörperfragmente in diversen Expressionsvektoren (pCANTAB 5E und pET15b) und Bakterienstämmen (HB2151 und BL21[DE3]) zu exprimieren, blieben stets ohne Erfolg. Während die VEGFR-2-scFv sowohl über die E-tag- (pCANTAB 5E-System, siehe 3.7.1) als auch über die His-tag-Polypeptidsequenz (pET15b-System, Daten nicht gezeigt) im Western Blot mit großen Ausbeuten nachgewiesen wurden, konnten die E-tag markierten CTA-scFv nur in sehr geringen Konzentrationen und ausschließlich im degradierten Zustand in periplasmatischen Extrakten sowie Kulturüberständen detektiert werden. Die mit His-tag- Polypeptiden markierten CTA-scFv-Moleküle wurden hingegen nicht einmal in degradierter Form im Western Blot ermittelt. Diese kontroversen CTA-scFv-Nachweisergebnisse sind höchst-wahrscheinlich auf die, zwischen den His-tag- und E-tag-Polypeptiden zu verzeichnenden, Längenunterschiede zurückzuführen. Aufgrund des Umstandes, dass das His-tag-Fragment (6 Aminosäuren) wesentlich kürzer ist als die korrespondierende E-tag-Sequenz (13

Amino-säuren), konnte es während der Sekretion der CTA-scFv zu einer sterischen Beeinflussung des His-tag-Polypeptides gekommen sein, welche dazu geführt hat, dass die sezernierten Antikörperfragmente „versteckt“ in den untersuchten Extrakten vorlagen und somit weder gereinigt noch detektiert werden konnten.

Die aus den Western Blot-Analysen gewonnenen Erkenntnisse wurden darüber hinaus mittels immunhistochemischer Färbungsexperimente bestätigt. Aus den erhaltenen Ergebnissen ging hervor, dass die löslichen VEGFR-2-scFv in der Lage waren, die auf den untersuchten Humangefäßschnitten vorhandenen Antigenstrukturen spezifisch zu erkennen.

Im Gegensatz dazu zeigten die CTA-scFv-Antikörper weder auf den humanen noch auf den Ratten-Kollateralgefäßen (Daten nicht gezeigt) detektierbare Antigen-Antikörperreaktionen.

Mit diesen Ergebnissen konnte eindeutig demonstriert werden, dass es sich bei den im Western Blot nachgewiesenen CTA-scFv-Banden um nichtaktive, fehlerhaft assemblierte oder sogar degradierte scFv-Antikörperfragmente handelte.

Die mit Hilfe einer computersimulierten Darstellung präsentierte räumliche Struktur von VEGFR-2- und CTA-scFv-Antikörpern (siehe Abb. 3.6.1.2) gab sogar einige Hinweise auf eventuelle Bindungs- bzw. Faltungsunterschiede zwischen den beiden scFv-Molekülen.

Während der VEGFR-2-spezifische A7-scFv eine sehr kompakte und eher zusammen-hängende Struktur mit einer deutlich ausgebildeten Antigenbindungstasche aufwies, zeigte der CTA-scFv-Antikörperfragment hingegen einen eindeutig ausgestreckten Konformations-zustand. Die beiden VH- und VL-Domänen des CTA-scFv waren in zwei entgegengesetzte Richtungen ausgestreckt und zeigten wenig Affinität zueinander. Diese ungewöhnlich ausgedehnte Form des CTA-scFv-Antikörpers hing möglicherweise mit der Struktur des CSA-Antigens zusammen. Die neuesten Untersuchungen des monoklonalen CTA-157-2-Antikörpers in unserer Arbeitsgruppe ergaben, dass dieser sowohl die α7- (26 kDa) als auch die ß3-Einheit (21 kDa) des 20S Ratten-Proteasoms spezifisch erkennt. Diese Befunde deuten darauf hin, dass es sich bei dem auf proliferierenden Kollateralgefäßen und RHE-A-Zellen nachgewiesenen CSA-Komplex möglicherweise um eine hochmolekulare und hochselektive Enzymeinheit handelt. Weil das 20S Proteasom einen zylindrisch angeordneten, heterodimeren Komplex darstellt, welcher aus mehreren Untereinheiten aufgebaut ist, erscheint es plausibel, dass das CTA-spezifische scFv-Antikörperfragment, um an weit auseinander lokalisierte Antigenepitope zu binden (wie im Fall des 20S Proteasoms), einen ebenfalls ausgestreckten, strukturellen Aufbau aufweisen muss. Mit diesen Erkenntnissen kann auch die deutlich stärkere Bindungsaktivität des aus 10 Valenzen bestehenden, monoklonalen CTA-157-2, welcher an gleichzeitig mehrere Untereinheiten des

CSA-Komplexes binden kann, gegenüber dem scFv-Fragment begründet werden. Während der ausgedehnte Konformationszustand des CTA-scFv-Antikörpers wesentliche Vorteile bei der Erkennung eines Antigen-Komplexes (wie z. B. des Proteasoms) bietet, kann er jedoch für die Generierung von löslichen scFv in bakteriellen E. coli-Systemen negative Konsequenzen haben. Die ausgedehnte scFv-Struktur könnte beispielsweise die Wanderung des CTA-scFv-Antikörpers durch die Zellmembran von E. coli-Bakterien, während der sekretorischen Vorgänge, erheblich erschweren und somit starke Ausbeute-Verluste oder sogar Proteindegradationen verursachen.

Trotz der vielen Vorteile, welche die Expression von Proteinen im prokaryontischen E. coli-System bietet (siehe Kapitel 1.4.3), konnten mit dieser Methode keine funktionellen CTA-spezifischen scFv-Antikörperfragmente generiert werden. Höchstwahrscheinlich ist dieses System nicht in der Lage, eine korrekte Faltung dieser Antikörperfragmente zu gewährleisten. Um die Funktionalität der einst phagenexprimierten, kollateralspezifischen scFv in Form von löslichen Proteinen zu untersuchen, sollten in künftigen Experimenten für die Produktion von rekombinanten Antikörperfragmenten alternative Expressionssysteme (z.B. Baculovirus-System; Maeda, 1989) herangezogen werden.