Nachweise der Heterogenität des Endothels verschiedenartiger, arterieller Gefäße

Die Entstehung von neuen Blutgefäßen erfordert eine komplexe Interaktion zwischen verschiedenen angio- bzw. arteriogenetischen Mediatoren und deren Rezeptoren. Während die meisten Kapillarwachstum stimulierenden Agenzien bereits ausführlich untersucht wurden, ist über die Kollateralwachstum fördernden Moleküle bisher wenig bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, mit Hilfe des CTA-157-2-Antikörpers sowie der eigenständig generierten, kollateralspezifischen scFv-Antikörperfragmente einen bislang unbekannten, auf Kollateralarterien vorhandenen CSA-Komplex nachzuweisen und zu loka-lisieren. Die, mit Hilfe immunhistochemischer Färbungstechniken vorgenommene, zelluläre Lokalisierung des untersuchten Antigen-Komplexes lieferte zum einen wichtige Aufschlüsse über sein Verteilungsmuster in den einzelnen Gefäßwandschichten und zum anderen einige Hinweise auf die Heterogenität verschiedenartiger, arterieller Gefäße.

4.3.1 Lokalisierung der CTA-Antigensignale auf Ratten- und Humangefäßen

Die Struktur und Funktionalität diverser, vaskulärer Endothelien wurde in der Vergangenheit oft untersucht und miteinander verglichen. In diesem Zusammenhang wurden ebenfalls Versuche unternommen, mit Hilfe von Phagen-Peptidbibliotheken, unterschiedliche Expressionsmuster endothelspezifischer Rezeptormoleküle auf Gefäßendothelien unter normalen bzw. pathologischen Bedingungen nachzuweisen sowie gewebespezifische Expression einiger, endothelialer Markermoleküle in Abhängigkeit von der

Gefäßlokalisie-rung aufzuzeigen (Trepel et al., 2002). Mit den, im Rahmen der vorliegenden Arbeit, durch-geführten Untersuchungen der CSA-Expression auf diversen arteriellen Gefäßen konnte die von einigen Autoren beschriebene „molekulare Heterogenität vaskulärer Endothelien“

(Rajotte et al., 1998) eindeutig bestätigt werden. Darüber hinaus ließ sich anhand der erhaltenen Ergebnisse feststellen, dass sogar zwischen den einzelnen arteriellen Gefäßarten deutliche Unterschiede in der Molekülausstattung existieren. In mehreren unabhängigen in situ Experimenten unter Verwendung des Ratten-Arteriogenese-Modells konnte gezeigt werden, dass der CSA-Komplex auf proliferierenden Kollateralgefäßen vorwiegend in der Intima und auf den nichtproliferierenden Kollateralarterien hauptsächlich in der Media bzw.

Adventitia lokalisiert ist. Eine ausführliche Analyse der Verteilung der CTA-157-2 bzw.

CTA-scFv-Antikörpersignale auf den wachsenden Kollateralgefäßen ergab, dass der untersuchte Antigen-Komplex besonders stark auf den Endothelzellen und nur sehr schwach auf den glatten Muskelzellen dieser Gefäße exprimiert wurde. Ein nahezu gegensätzliches CSA-Expressionsmuster wurde auf den nichtproliferierenden Kollateral- sowie Kontroll-gefäßen beobachtet, wo eine spezifische Immunreaktion hauptsächlich auf den glatten Muskelzellen und nur vereinzelt in der Endothelschicht detektiert werden konnte. Die Resultate der vorliegenden Untersuchungen lassen letztlich darauf schließen, dass der CSA-Komplex vorwiegend auf den arteriogenetischen Gefäßen (proliferierende Kollateralgefäße) exprimiert wird. Diese Beobachtungen konnten ebenfalls durch Untersuchungen der CTA-Antikörpersignale auf proliferierenden Tumorgefäßen bestätigt werden. Demzufolge wurden auf den, während der Tumorangiogenese entstandenen, proliferierenden Kapillargefäßen, im Gegensatz zu den proliferierenden Kollateralarterien (s.o.), keine CSA-Antigensignale registriert. Aufgrund dieser Befunde kann spekuliert werden, dass der untersuchte CSA-Komplex möglicherweise bei dem Prozess der Arteriogenese eine wichtige Rolle spielt.

Neben den oben erwähnten Unterschieden in der CSA-Expression auf diversen Gefäßarten wurde mittels weiterer, immunhistochemischer Färbungsexperimente zusätzlich auch eine speziesabhängige Heterogenität proliferierender Kollateralarterien nachgewiesen.

Im Humanmodell konnte, ähnlich wie auf Rattengefäßen, die stärkste CSA-Antigen-expression auf wachsenden Kollateralgefäßen detektiert werden. Dennoch wurden auf den proliferierenden Humangefäßexemplaren, anders als im Rattenmodell, die meisten CTA-Antikörpersignale in den glatten Muskelzellen lokalisiert. Die Endothelschicht dieser Gefäße wies nur vereinzelte Farbreaktionen auf. Die daraus resultierende, speziesabhängige Heterogenität der Kollateralgefäße kann zum einen auf genetische Differenzen zwischen den Ratten- bzw. Humangefäßen (Schaper und Schaper 2004) und zum anderen auf die

unterschiedliche Größe der untersuchten Kollateralarterien zurückgeführt werden. Ein morphologischer Vergleich der jeweiligen Gefäßstrukturen untereinander zeigte, dass die Media der proliferierenden, humanen Kollateralarterien aus wesentlich mehr Schichten von glatten Muskelzellen aufgebaut ist als die Media der korrespondierenden Rattengefäße.

Höchstwahrscheinlich sind, aufgrund der unterschiedlichen Gefäßwandstärke, die beim Kollateralwachstum wirkenden hämodynamischen Kräfte (z. B. radiäre Spannung oder Dehnungsreize) in den Humangefäßen ganz anders verteilt als in den Rattengefäßen. Damit könnte wiederum die unterschiedliche Expression von strömungsregulierenden Genen oder anderen arteriogenetischen Molekülen (z.B. CSA-Komplex) in den untersuchten Spezies-Modellen erklärt werden.

Trotz unterschiedlicher Verteilung der CTA-Antikörpersignale in den untersuchten Gefäßen kann jedoch festgehalten werden, dass die Expression des CSA-Komplexes in beiden Arteriogenese-Modellen (Ratte und Human) mit den proliferativen Effekten des Gefäßwachstums korrelierte. Bemerkenswert in diesem Zusammenhang ist dennoch die Beobachtung, dass beim Wachstum von Ratten-Kollateralgefäßen vorwiegend die Endothelzellen während bei der Arteriogenese von humanen Kollateralarterien hauptsächlich die glatten Muskelzellen proliferierten.

4.3.2 Verteilungsmuster der VEGFR-2-Antikörpersignale auf Humangefäßen

VEGFR-2 (KDR) gehört zu den wichtigsten Regulatoren der Vaskulogenese und Angiogenese (auch Tumorangiogenese) und wird während dieser Prozesse in wachsenden Blutgefäßen verstärkt exprimiert (Millauer et al. 1993). In ruhenden (nicht wachsenden) Gefäßen wird dieser Rezeptor in der Regel herunterreguliert (Risau, 1997). Eine Ausnahme-situation konnte dennoch in Blutgefäßen humaner Nieren beobachtet werden, wo eine erhöhte VEGFR-2-Expression nicht mit der Gefäßneubildung, sondern mit der vaskulären Permea-bilität im Nierenglomerulus zusammenhing (Simon et. al. 1998).

Aufgrund der Tatsache, dass der VEGFR-2 in angiogenetischen Vorgängen eine wichtige Rolle spielt, wurde in der vorliegenden Arbeit der Frage nachgegangen, ob und in welchem Ausmaß dieser sogenannte, proangiogenetische Faktor während des Wachstums von Kollateralgefäßen (Arteriogenese) exprimiert wird. Dazu wurde, unter der Verwendung von VEGFR-2-spezifischen A7-scFv-Antikörperfragmenten, das Expressionsmuster dieses Rezep-tors auf humanen Kollateralgefäßen mittels „Biopanning“ sowie immunhistochemischer Färbungsexperimente untersucht. Der Einsatz von Einzelkettenantikörpern zur Beantwortung ähnlicher Fragestellungen ist in der Vergangenheit bereits mehrmals beschrieben worden.

Böldicke et al. (2001) ist es gelungen, mit Hilfe eigenständig generierter, löslicher A7-scFv-Antikörperfragmente die Expression von VEGFR-2 in der Interlobulararterie der humanen Niere und in den Glomerulus-Kapillaren immunhistochemisch nachzuweisen. Besonders interessant in diesem Zusammenhang war die Beobachtung, dass die detektierten Expressionssignale ausschließlich in der Endothelschicht der untersuchten Gefäße lokalisiert waren. Die glatten Muskelzellen zeigten hingegen keine Antigen-Antikörper-Reaktionen. In Anlehnung an die oben erwähnten Experimente wurden für die Suche nach VEGFR-2-Expressionssignalen auf den humanen Kollateralgefäßen (anders als bei Böldicke) phagen-exprimierte A7-scFv-Antikörperfragmente verwendet. Die Resultate dieser Untersuchungen zeigten, dass die A7-scFv-Phagen in der Lage waren, VEGFR-2-Epitope sowohl auf den proliferierenden Kollateralgefäßen (von Patienten mit akuter Ischämie) als auch auf den Kontrollarterien (von Kontrollpatienten) spezifisch zu erkennen. Überraschenderweise musste anhand der „Biopanning“-Ergebnisse festgestellt werden, dass die VEGFR-2-Phagen auf den Kontrollgefäßen viel stärker angereichert waren als auf den wachsenden Kollateralarterien.

Zur Verifizierung der „Biopanning“-Daten sowie zur Lokalisierung der KDR-Antigensignale wurden immunhistochemische Analysen durchgeführt. Auch anhand dieser Untersuchungen konnte eine deutlich stärkere VEGFR-2-Expression auf den Gefäßen vom Kontrollpatienten verzeichnet werden. Die KDR-spezifischen Antigen-Antikörpersignale waren hierbei sowohl im Endothel als auch auf den glatten Muskelzellen sehr gleichmäßig verteilt. Auf den proliferierenden Kollateralarterien vom Patienten mit akuter Ischämie wurde ebenfalls VEGFR-2-Expression nachgewiesen. Die spezifischen Farbsignale waren jedoch weniger stark ausgeprägt und wurden, im Kontrast zu den Ergebnissen von Böldicke (s.o.), vorwiegend in den glatten Muskelzellen dieser Gefäße lokalisiert. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass es mit Hilfe von phagenexprimierten, VEGFR-2-spezifischen A7-scFv-Antikörperfragmenten gelungen ist, die KDR-Expression auf humanen Kollateralarterien erfolgreich nachzuweisen. Durch genaue Lokalisierung der Antigen-Antikörpersignale konnte ebenfalls die Heterogenität verschiedener, arterieller Gefäße im Humanmodell aufgezeigt werden. Des Weiteren ging aus den durchgeführten Untersuchungen hervor, dass die VEGFR-2-Expression nicht mit der Proliferation von Gefäßen im Rahmen der Arteriogenese einhergeht. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass möglicherweise wesentliche Unterschiede in der Expression und Funktionalität des VEGFR-2 zwischen den angio- und arteriogenetischen Gefäßen existieren.

4.4 Affinitätsunterschiede zwischen gefäßspezifischen scFv-Antikörpern