5.2 TMPyP mit Proteinen
5.2.1 Sauerstoffverbrauch
Um den Einfluss des Sauerstoffverbrauchs der Proteine w¨ahrend den folgenden Lumineszenz-Messungen bestimmen zu k¨onnen, wurde von jedem Protein eine Protein-TMPyP-L¨osung erstellt. Die Farbstoff-Konzentration betrug dabei bei allen vier L¨osungen 50 µmol/L. Die Proteine wurden einzeln mit einer Konzentration von 2 mg/ml in dem Farbstoff-Wasser-Gemisch gel¨ost. Bei jeder Messung wurden 3 ml des Farbstoff-Protein-Wasser-Gemisches in eine Quarzglask¨uvette gef¨ullt, die mit einem Teflon-Stopfen verschlossen, mit Parafilm abgedichtet und mit einem Magnetr¨uhrer durchmischt wurde. Anschließend wurde das Gemisch durchgehend mit dem Laser (532 nm, 2 kHz, 50 mW) bestrahlt. Mit dem in den Teflon-Stopfen integrierten Nadel-Sensor wurde die Sauerstoff-Konzentration in der L¨osung gemessen.
Abbildung 5.4 zeigt, dass bei gleichen Massenkonzentrationen der Proteine die Ge-schwindigkeit der Oxidation stark von der Molek¨ulgr¨oße abh¨angt, aber auch der Anteil der oxidierbaren Aminos¨auren kann eine Rolle bei der Oxidationsgeschwin-digkeit spielen.
Bei der Oxidation der Aminos¨auren bestimmt nur die Menge an gebildetem Singulett-Sauerstoff die Reaktionsgeschwindigkeit, da die Menge der Aminos¨auren (ca. 20 mmol/L) im Vergleich zu der des Singulett-Sauerstoffs (gesamter Sauerstoff: 0,27 mmol/L) im ¨Uberschuss vorhanden ist. Da aber die Menge des Singulett-Sauerstoffs nahezu unabh¨angig von der Sauerstoff-Konzentration ist (Φ∆ist konstant ¨uber einen großen Bereich der Sauerstoff-Konzentration [5]) und nur von der durch den
Pho-5.2. TMPYP MIT PROTEINEN
0 20 40 60 80 100 120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sauerstoffgehalt [%]
Bestrahlungszeit [min]
Albumin Trypsin Inhibitor
Insulin Angiotensin
Abbildung 5.4:Der Sauerstoffgehalt der Proteinl¨osungen mit 50µmol/L TMPyP gegen die Bestrahlungszeit; dazu die Geraden mit einem angenommenen konstanten Sauerstoffverbrauch
tosensibilisator absorbierten Lichtenergie abh¨angt, ist die Reaktionsgeschwindigkeit unabh¨angig von der Konzentration der Reaktionspartner und die zeitabh¨angige Kon-zentration des Sauerstoffs kann beschrieben werden mit einer Reaktion nullter Ord-nung: [O2(t)] = [O2]0 - k · t.
Die Dimension von k ist [mol· l−1· s−1].
Diese Annahme gilt jedoch nur f¨ur photostabile Farbstoffe, hohe Aminos¨auren-Konzentrationen (¨uber 1 mmol/L) und in einem Bereich, in dem sich die Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute nicht ¨andert. Diese Einschr¨ankung ist bereits in Abbil-dung 5.4 zu erkennen, da die Reaktionsgeschwindigkeit bei Sauerstoff-Konzentrationen unter 10% der Lufts¨attigung (ca. 30 µmol/L) abnimmt.
In Abbildung 5.4 sind die Geschwindigkeitskoeffizienten durch lineare Fitgeraden bestimmt, die an die Messwerte bis zu einer Sauerstoff-Konzentration von 30 µmol angepasst werden. Bei der vorliegenden Messung ergeben sich die in Tabelle 5.2 an-gegebenen Geschwindigkeitskoeffizienten mit einem Fehler von 10%.
Bei Angiotensin nimmt die Sauerstoff-Konzentration w¨ahrend einer typischen Mess-dauer von 10 Sekunden um bis zu 47 µmol ab. Dies f¨uhrt dazu, dass sich die Rate KT1 w¨ahrend der Messung ¨andert, nach
KT1 := kT1 + (kT1O2 +kT1∆)[O2] +kT1S0[P] +kT1Q[Q]. (5.1)
KAPITEL 5. SINGULETT-SAUERSTOFF-INTERAKTION MIT BIOMOLEK ¨ULEN
Protein/Peptid Geschwindigkeitskoeffizient Albumin 0,8 µmol · L−1· s−1 Trypsin Inhibitor 1,1 µmol · L−1· s−1 Insulin 2,7 µmol · L−1· s−1 Angiotensin 4,7 µmol · L−1· s−1
Tabelle 5.2:Geschwindigkeitskoeffizient des Sauerstoffverbrauchcs verschiedener Proteine/Peptide (2 mg/mL) in TMPyP-Wasser-Gemischen (TMPyP-Konzentration = 50 µmol/L) bei 50 mW eingestrahlter Leistung
Somit k¨onnen nur noch Mittelwerte zwischen der Anfangs- und Endkonzentration des Sauerstoffs bestimmt werden, aus denen wiederum nur Absch¨atzungen der Rate KT1 bei bestimmten Sauerstoff-Konzentrationen m¨oglich sind.
Wie bereits fr¨uher gezeigt [50], wurden bei einer Laserleistung von 100 mW ohne Einsatz eines Magnetr¨uhrers etwa 40 Joule ben¨otigt, um den Sauerstoff in einer L¨osung mit 2 mg/ml Albumin und 50 µmol/L TMPyP unter das Detektionsmini-mum zu senken. In dieser Messung bei 50 mW mit einem Magnetr¨uhrer wurden hingegen nur etwa 30 Joule ben¨otigt, um den gleichen Effekt zu erzielen.
Dies zeigt, dass der Sauerstoffverbrauch nicht nur von der eingestrahlten Energie abh¨angt, sondern auch von der lokalen Konzentration des Sauerstoffs und der oxi-dierbaren Proteine. Das soll heißen, dass bei einer niedrigeren Leistung und dem st¨andigen Durchmischen der Probe die Reaktion von Singulett-Sauerstoff und Pro-teinen wahrscheinlicher wird als wenn der Ausgleich der Sauerstoff-Konzentration nur durch Diffusion erfolgt. Es ist somit mit Magnetr¨uhrer weniger Gesamtenergie f¨ur den Verbrauch des gesamten Sauerstoffs notwendig, da immer gen¨ugend Sauer-stoff zur Oxidation im Anregungszentrum zur Verf¨ugung steht. Des weiteren kann aus diesen Messungen gefolgert werden, dass sich f¨ur Albumin die Messbedingun-gen am langsamsten ¨andern und sich f¨ur eine Einzelmessung von 10 Sekunden ( ˆ= 0,5 Joule bei einer Leistung von 50 mW) die Sauerstoff-Konzentration nur um et-wa 3% ( ˆ= 8 µmol/L) ¨andert. Im Vergleich dazu tritt die gleiche Ver¨anderung der Sauerstoff-Konzentration bei Angiotensin in nur 1,7 Sekunden auf.
5.2. TMPYP MIT PROTEINEN
5.2.2 Bestimmung der Raten und Ratenkonstanten bei Albumin-TMPyP-Gemischen
Die Bestimmung der Raten und Ratenkonstanten erfolgte im weiteren Verlauf nur bei Albumin-TMPyP-L¨osungen, da bei diesen der Sauerstoffverbrauch w¨ahrend der Bestrahlung am geringsten (Tab. 5.2) und somit die Messbedingungen am stabilsten sind.
Die Variation der Sauerstoff-Konzentration erfolgt bei einer Farbstoff-Konzentration von [P] = 100 µmol/L und einer Albumin-Konzentration von [Q] = 2 mg/ml = 30 µmol/L. In Abbildung 5.5 sind die Raten β1 und β2 in Abh¨angigkeit von der Sauerstoff-Konzentration aufgetragen.
Die Variation der Farbstoff-Konzentration wurde bei 20% und 80% Sauerstoffs¨atti-gung (54 und 216 µmol/L) durchgef¨uhrt, um wie in Abbildung 5.5 ersichtlich links und rechts des Schnittpunkts (K∆ = KT1) zu messen. Die Albumin-Konzentration betr¨agt in beiden F¨allen wieder 30 µmol/L. Die TMPyP-Konzentration wurde zwi-schen [P] = 10µmol/L und [P] = 500µmol/L variiert. Abbildung 5.6 zeigt die Raten in Abh¨angigkeit von der Farbstoff-Konzentration bei 54 µmol/L Sauerstoff (K∆ >
KT1) (A) und bei 216µmol/L Sauerstoff (K∆< KT1) (B).
Die Variation der Protein-Konzentration erfolgt bei einer Farbstoff-Konzentration von [P] = 100 µmol/L und einer Sauerstoff-Konzentration von [O2] = 54 µmol/L.
Die Protein-Konzentration wurde zwischen [Q] = 7,5µmol/L und [Q] = 750µmol/L variiert. Wie in Abbildung 5.7 ersichtlich schneiden sich die Raten β1 und β2 nicht, so dass β1 ≈K∆ und β2 ≈ KT1 gilt.
Bei allen Messungen wurde die L¨osung mit einem Magnetr¨uhrer durchmischt, um den Sauerstoff-Gradienten im Bereich der Laseranregung m¨oglichst gering zu halten.
F¨ur die Bestimmung der Raten wurden nur die Signale von 2000 Laserpulsen (100 mW Leistung) aufsummiert, um so wenig Sauerstoff wie m¨oglich zu verbrauchen.
Es muss aber ber¨ucksichtigt werden, dass die Sauerstoff-Konzentration w¨ahrend der Messung immer noch um ca. 1,5 µmol/L abnimmt.
KAPITEL 5. SINGULETT-SAUERSTOFF-INTERAKTION MIT BIOMOLEK ¨ULEN
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
0,5
Abbildung 5.5: Anstiegs- (β1) und Abklingraten (β2) aus der Variation der Sauerstoff-Konzentration in einer TMPyP-Albumin-L¨osung (Farbstoff-Konzentration: 100 µmol/L, Albumin-Konzentration: 2 mg/ml = 30 µmol/L); die Fehlerbalken sind der ¨Ubersicht halber nur einmal f¨ur die gr¨oßten Werte eingezeichnet.
Abbildung 5.6: Anstiegs- (β1) und Abklingraten (β2) aus der Variation der Farbstoff-Konzentration in einer TMPyP-Albumin-L¨osung (Sauerstoff-Konzentration: 54 µmol/L (A) und 216 µmol/L (B), Albumin-Konzentration: 2 mg/ml = 30 µmol/L)
5.2. TMPYP MIT PROTEINEN
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0,2 0,4 0,6 0,8
00
[Albumin] [mmol/L]
β ,β1 2 [1/µs]
β1
β2 KT1
KΔ
Abbildung 5.7:Anstiegs- (β1) und Abklingraten (β2) aus der Variation der Albumin-Konzentration in einer TMPyP-Albumin-L¨osung (Farbstoff-Konzentration: 100 µmol/L, Sauerstoff-Konzentration: 54 µmol/L)
Die aus den verschiedenen Variationen der Konzentrationen ermittelten Raten, so-wie die Raten ohne Albumin aus Kapitel 4 und die bekannten Literaturwerte sind in Tabelle 5.3 angegeben.
Rate/ TMPyP TMPyP TMPyP Einheit
Ratenkonstante mit Albumin ohne Albumin Literaturwerte
k∆ 0,27 ± 0,02 0,28 ± 0,01 0,29 ± 0,02 µs−1
kT1 <0,011 <0,006 0,007 ± 0,001 µs−1
kΣT1O 1,7 ± 0,2 1,9 ± 0,1 1,8 ± 0,2 µs−1· mmol−1·L k∆S0+ k∆T1 <0,08 <0,1 µs−1· mmol−1·L
kT1S0 <0,03 <0,001 µs−1· mmol−1·L
kT1∆· k∆T1 <0,2 <0,08 µs−2·mmol−2·L2 k∆Q 0,45 ± 0,10 0,6 ±0,05 (NaN3) (0,45 ±0,03)a µs−1· mmol−1·L kT1Q n.b. <0,005 (NaN3) µs−1· mmol−1·L Tabelle 5.3:Ubersicht ¨uber die Raten und Ratenkonstanten von TMPyP in Wasser mit¨
und ohne Albumin und den vorhandenen Literaturwerten ohne Albumin (a mit Albumin) [9]
Bei der Variation der Protein-Konzentration (Abb. 5.7) bei einer Sauerstoff-Konzen-tration von 54 µmol/L entspricht die Rate β2 der Farbstoff-Triplett-Abklingrate
KAPITEL 5. SINGULETT-SAUERSTOFF-INTERAKTION MIT BIOMOLEK ¨ULEN
KT1. Bei einem quenchenden Effekt des Albumins m¨usste die Rate β2 mit steigender Albumin-Konzentrationen ansteigen (wie bei Natriumazid als Quencher beschrie-ben). Durch den lokalen Verbrauch von Sauerstoff zeigt sich allerdings die Sauerstoff-Abh¨angigkeit der Rate KT1 (siehe oben), deren Wert mit sinkendem Sauerstoff-Gehalt ebenfalls sinkt. Daher ¨uberlagert dieser Effekt die quenchenden Eigenschaf-ten des Albumins und die RaEigenschaf-tenkonstante w¨urde einen negativen Wert annehmen, der nicht mit der Theorie ¨ubereinstimmt. Des weiteren kann die Bindung von Prote-inen an den Farbstoff [9] den Farbstoff-Triplett-Zustand beeinflussen. Dies legt auch die Ver¨anderung der Raten- und Ratenkonstanten nahe, die sich auf den Farbstoff-T1-Zustand beziehen. So vergr¨oßern sich kT1, kT1S0 und das Produkt kT1∆· k∆T1, was auf eine insgesamt schneller Deaktivierung des Farbstoff-T1-Zustands durch das L¨osungsmittel und den Farbstoff selbst schließen l¨asst.
Die Abbildungen zeigen, dass aus den Messergebnissen nicht mit Sicherheit ent-schieden werden kann, ob ein Energier¨ucktransfer vom Singulett-Sauerstoff auf den Triplett-Zustand von TMPyP erfolgt. Die Gr¨oße des Fehlers bei der Ratenbestim-mung l¨asst sowohl eine Zuordnung zu den analytisch ermittelten Kurven mit (durch-gezogene Linien) als auch ohne (gestrichelte Linien) Energier¨ucktransfer zu.
Ein ¨Uberblick ¨uber die hier ermittelten Raten und Ratenkonstanten und ein Ver-gleich mit denen mit Fetts¨auren erfolgt in Abschnitt 5.6.