6.5 Bedeutung der Raten und deren Interpretation
7.1.1 Aufbau von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen
In der Natur existieren zwei grundverschiedene Zellgruppen, die sich auf Grund ih-rer Gr¨oße und internen Struktur unterscheiden: prokaryotische (griechisch: pro = bevor, karyon = Kern) und eukaryotische (griechisch: eu = echt, karyon = Kern) Zellen. Zu den von der Struktur her einfachen prokaryotischen Zellen geh¨oren die Bakterien, w¨ahrend Pilze, Pflanzen und Tiere strukturell komplexe eukaryotische Zellen besitzen.
F¨ur die Gruppe der eukaryotischen Zellen wurden in diesem Kapitel zwei Zelltypen untersucht: humane kolorektale Adenokarzinom-Zellen (HT29-Zellen), Darmkrebs-zellen, die in der Zellmembran eine geringe Protein-Konzentration aufweisen [4], sowie native humane epidermale Keratinozyten (NHEK-Zellen), Keratinozyten, die den Hauptbestandteil der menschlichen Haut darstellen. Aus der Gruppe der Proka-ryoten wurden der Gram-positiveStaphylococcus aureus (S. aureus), der fast ¨uberall in der Natur vorkommt, und das Gram-negative Colibakterium (Escherichia coli,E.
Coli), das weltweit mit am besten untersucht Bakterium, ausgew¨ahlt.
Dieeukaryotische Zellebildet die grundlegende, strukturelle und funktionelle Ein-heit aller h¨oheren Lebewesen, wohingegen Prokaryoten immer Einzeller sind. Die verschiedenen Zelltypen unterscheiden sich nicht nur in ihrer Gr¨oße (Prokaryoten:
0,5 - 5µm, Eukaryoten: 5 - 100µm) [1], sondern auch in ihrem Zellaufbau. So besit-zen Eukaryoten einen Zellkern, der von einer Kernmembran umgeben ist. Außerdem sind die eukaryotische Zellen mittels Zellorganellen strukturiert, um ein
reibungslo-KAPITEL 7. SINGULETT-SAUERSTOFF-INTERAKTION MIT ZELLEN UND BAKTERIEN
ses Funktionieren der zellul¨aren Abl¨aufe ¨uber gr¨oßere Entfernungen innerhalb der Zelle zu erm¨oglichen. Die in dieser Arbeit wichtigen Zellorganellen sind die Plasma-membran, das Zytoplasma, der Zellkern und verschiedene Vesikel.
Die Zellwand (Plasmamembran, Abbildung 7.1) umgibt die Zelle und trennt das Innere der Zelle von der Umgebung. Sie besteht, ebenso wie die Membranh¨ullen einiger Zellorganellen, aus einer Lipiddoppelschicht und ist mit einer St¨arke von et-wa 6–10 nm lichtmikroskopisch auf Grund von Beugungseffekten h¨ochstens als vage Linie erkennbar. Um die Lipiddoppelschicht flexibel zu halten werden unges¨attigte Fetts¨auren in die Membranen eingelagert.
Jede Zelle identifiziert sich mit Hilfe ihrer peripheren Proteine nach außen hin. Diese Membranproteine liegen oder “schwimmen“ auf oder in der Membran. Zus¨atzlich da-zu h¨angen da-zur Markierung an der Außenseite der Zellmembran oft kurzkettige, teil-weise b¨aumchenartig verzweigte Kohlenhydratverbindungen an den Proteinen und den Lipiden. Man spricht dann von Glykoproteinen bzw. Glykolipiden. Die meisten Zellen besitzen ein Membranpotential zwischen Innen und Außen. Es entsteht durch unterschiedliche Stoff- und Ladungsverteilung ein elektrochemischer Gradient.
Abbildung 7.1: Die schematische Struktur einer Plasmamembran einer eukaryotischen Zelle
7.1. MATERIAL UND METHODEN
Als Zytoplasma wird der die Zelle ausf¨ullende Inhalt bezeichnet, der aus dem Zy-tosol (Zellmedium) besteht und dem Zytoskelett und die Organellen enth¨alt. Es ist von der Plasmamembran eingeschlossen, wodurch die Zellen voneinander abgegrenzt Stoffwechselprozesse durchf¨uhren k¨onnen. Das Zytosol besteht aus Wasser und darin gel¨osten Ionen, kleinen Molek¨ulen (Aminos¨auren) und gr¨oßeren wasserl¨oslichen Mo-lek¨ulen, wie zum Beispiel Proteinen. Der Proteinanteil des Zytosols liegt bei 20–30%.
Je nach Zelltyp befinden sich 25–50% der Gesamtproteinmenge im Zytosol.
Der Zellkern, welcher bei S¨augern typischerweise einen Durchmesser von 5 bis 16 µm hat, ist das im Mikroskop am leichtesten zu erkennende Organell der Zelle. Er ist durch die Kernh¨ulle, bestehend aus zwei biologischen Membranen, der inneren und ¨außeren Kernmembran, begrenzt. Zellkerne k¨onnen durch Anf¨arben der DNA lichtmikroskopisch hervorgehoben werden, z. B. durch die F¨arbung mit Fluoreszenz-farbstoffen wie Hoechst 33342.
Je nach Art der in ihnen nachweisbaren Enzyme unterscheidet man verschiedene Typen von Vesikeln: Lysosome, Peroxisome und Mikrosome. Lysosome sind enzym-haltige Vesikel (Bl¨aschen mit einem Durchmesser unter 100 nm [36]), die von einer Membran (einfache Lipiddoppelschicht) umschlossen sind. Meistens entstammen sie dem endoplasmatischen Retikulum (ER) oder dem Golgi-Apparat (prim¨are Lysoso-men) und dienen dem Proteintransport sowie dem Abbau von aufgenommenen Stof-fen (sekund¨are Lysosomen). Des weiteren gibt es sogenannte Autolysosomen, die zel-leigenes Material und ganze Zellorganellen abbauen, was zur st¨andigen Erneuerung der Organellen und der Beseitigung ¨uberfl¨ussiger Strukturen beitr¨agt. Peroxisomen sind evolution¨ar sehr alte Zellorganellen und gelten als die ersten Entgiftungsappara-te, die mit dem Auftreten einer sauerstoffhaltigen Atmosph¨are erforderlich wurden.
Es handelt sich um kleine (0,5 µm Durchmesser), membranumh¨ullte Vesikel, die sich im Zytoplasma einer Zelle befinden. In diesen r¨aumlich abgetrennten Bereichen (Kompartimenten) k¨onnen, durch die Membran gesch¨utzt, Reaktionen ablaufen, die f¨ur den Organismus, gef¨ahrlich w¨aren, w¨urden sie im Zytoplasma erfolgen, zum Beispiel Zerst¨orung von Bakterien durch Erniedrigung des pH-Wertes. Mikrosomen sind kleine (ca. 100 nm im Durchmesser) membran-begrenzte Vesikel innerhalb von Zellen. Es handelt sich um Fragmente des glatten bzw. rauen endoplasmatischen
KAPITEL 7. SINGULETT-SAUERSTOFF-INTERAKTION MIT ZELLEN UND BAKTERIEN
Retikulums (ER), die z. B. auch bei der Homogenisierung von Gewebe entstehen.
Die weiteren Organellen sind in Abbildung 7.2 zu sehen und sind hier nicht n¨aher erl¨autert.
Plasmamembran Mitochondrium
Centriol Vakuole
Lysosom
Kernmembran Nucleolus
Chromatin Kernpore
Nucleus
Ribosomen
Golgikomplex
Microfilamente Zytoplasma
glattes
endoplasmatisches Retikulum
raues
endoplasmatisches Retikulum
Microtubuli
Abbildung 7.2:Struktur eine eukaryotischen, tierischen Zelle; nicht maßstabsgetreu
Lipophile und kleine, ungeladene aber polare Molek¨ule, wie beispielsweise Wassermo-lek¨ule, k¨onnen durch Diffusion in die Zelle gelangen oder diese verlassen. Dabei fol-gen sie immer dem Konzentrationsgef¨alle, mit dem Bestreben dieses auszugleichen.
Gr¨oßere Molek¨ule wie Ionen, Zucker oder Aminos¨auren, f¨ur die die Lipiddoppel-schicht ohne Proteine un¨uberwindlich w¨are, k¨onnen mit Hilfe von Membrantransport-Proteinen aktiv oder passiv vom Inneren der Zelle nach Außen oder umgekehrt transportiert werden. Der passive Transport erfolgt dabei ohne jegliche Zuf¨uhrung von Energie in die Richtung eines Konzentrations- oder Potentialgef¨alles.
Beim aktiven Transport k¨onnen Stoffe auch gegen ein Konzentrationsgef¨alle durch die Membran transportiert werden, verbrauchen dann aber Energie. Die Gr¨oße der Molek¨ule ist dabei unwichtig. Beim prim¨ar aktiven Transport wird ein Ion durch eine sogenannte Ionenpumpe von der Seite der niedrigeren auf die Seite der h¨oheren Konzentration gepumpt. Der sekund¨ar aktive Transport bef¨ordert ein Ion passiv
ent-7.1. MATERIAL UND METHODEN
lang seines Konzentrationsgradienten und nutzt dabei die potentielle Energie dieses Gradienten aus, um ein zweites Substrat gegen dessen Konzentrationsgradienten in gleicher Richtung (Symport) bzw. in entgegengesetzter Richtung (Antiport) zu transportieren.
Die Aufnahme von Farbstoffen erfolgt bei den Zellen passiv auf Grund der Diffusion und funktioniert daher um so besser, je kleiner das Molekulargewicht des Farbstoffs ist (vgl. Kapitel 2.7) [37]. Auch die Polarit¨at der Farbstoffmolek¨ule oder eine positi-ve Ladung beschleunigen die Aufnahme der Farbstoffe. Es ist jedoch auch m¨oglich, dass sich die Farbstoffe an Proteine binden [9] und dadurch die physikalischen Eigen-schaften ver¨andert werden, zum Beispiel eine Verringerung der Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute.
Die prokaryotischen Zellen, zu denen die Bakterien geh¨oren, besitzen im Ge-gensatz zu den eukaryotischen einen wesentlich einfacheren Aufbau. So enthalten Bakterien keinen Zellkern mit einer Kernmembran, sondern die DNA befindet sich frei im Zytoplasma als Kern¨aquivalent oder auch Nucleoid. Des weiteren sind pro-karyotische Zellen nicht kompartimentiert und enthalten keine Organellen außer Ribosomen (Abbildung 7.3).
Abbildung 7.3: Struktur einer prokaryotischen Zelle (hier: Bakterium)
Die Plasmamembran ist ¨ahnlich aufgebaut wie die der eukaryotischen Zellen und fungiert auch hier als selektiv-permeable Trennwand zwischen der lebenden und der
KAPITEL 7. SINGULETT-SAUERSTOFF-INTERAKTION MIT ZELLEN UND BAKTERIEN
unbelebten Welt. Die Bakterien k¨onnen zus¨atzlich noch von einer starren Zellwand umgeben sein. Weiter kann eine Kapsel als zus¨atzlicher Schutz vorhanden sein. Ihre Dicke kann je nach Stamm variieren und kann bei allen positiven sowie Gram-negativen Bakterien vorkommen. Man kann daher bei d¨unneren Schichten von einer Schleimh¨ulle und bei dickeren Schichten von einer Kapsel sprechen. Oft sind diese Schichten sogar dicker als das Bakterium selbst.
Die Gram-F¨arbung ist eine Methode zur Einf¨arbung der Zellwand von Bakterien, so dass diese unter dem Mikroskop differenziert erscheinen. Die Gram-F¨arbung ist nach dem d¨anischen Arzt und Bakteriologen Hans Christian Gram benannt, der sie ca. Ende des 19. Jahrhunderts entwickelte. Verschiedene Bakterien reagieren auf diese F¨arbung unterschiedlich. Daraus folgt eine Einteilung in sog. Gram-positive Bakterien, die violett/blau erscheinen, und Gram-negative Bakterien, die eine rote F¨arbung zeigen. Dies ist ein wichtiges Kriterium f¨ur die Unterscheidung verschie-dener Bakterien, z.B. bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten. Gram-positive und Gram-negative Bakterien reagieren unterschiedlich auf Antibiotika. Mit dieser schnellen diagnostischen Methode kann man in kurzer Zeit (ca. 5 Minuten) anhand eines Abstrichs das Gram-Verhalten der Bakterien bestimmen. Damit hat man die M¨oglichkeit, sofort mit einer antibiotischen Therapie zu beginnen, bevor das Ergeb-nis der, oft mehrere Tage dauernden definitiven Keimbestimmung vorliegt.
In dieser Arbeit wurden sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien un-tersucht. Staphylococcus aureus (S. aureus) sind kugelf¨ormige, Gram-positive Bak-terien, die h¨aufig in Trauben angeordnet sind. Sie sind unbeweglich und bilden keine Sporen. Die Gr¨oße des Bakteriums liegt ¨ublicherweise zwischen 0,8 und 1,2µm. Sta-phylococcus aureus z¨ahlt zu den h¨aufigsten Erregern im Krankenhaus erworbener Infektionen. Der Erreger ist ¨außerst widerstandsf¨ahig gegen Einfl¨usse wie Austrock-nung und kann eine Reihe von Resistenzen gegen ¨uber Antibiotika aufweisen.
In Abbildung 7.4 A ist die umgebende Membran der Gram-positiven Bakterien schematisch dargestellt. Als Basis dient, wie bei den eukaryotischen Zellen, die Plas-mamembran aus einer Lipiddoppelschicht, die das Zytoplasma einschließt. In dieser inneren Membran werden Proteine ein- und angelagert, die unterschiedlich weit in sie hinein- oder sogar durch sie hindurch reichen. Gram-positive Bakterien besitzen
7.1. MATERIAL UND METHODEN
zus¨atzlich eine etwa 15 - 80 nm dicke Zellwand, bestehend aus bis zu 100 Schichten von Peptidoglykanen (Zucker-Eiweiß-Molek¨ule), in welche Teichons¨auren, mit und ohne Lipidanteil, vernetzt sind. Proteine sind mit in die Peptidoglykanschichten ein-gebettet.
A Gram (+)
Teichonsäuren Proteine Peptidoglykanen
Zytoplasma Lipidmembran
Lipopolysacchariden
Porine
bilaminäre Lipidmembran Proteine
Periplasma Peptidoglykanen
Zytoplasma Lipidmembran B Gram (-)
Abbildung 7.4:Schematischer Aufbau der Bakterien umgebenden Zellwand von (A) Gram-positiven und (B) Gram-negativen Bakterien [52]
Escherichia coli ist ein Gram-negatives, st¨abchenf¨ormiges und begeißeltes Bakte-rium, das im menschlichen und tierischen Darm vorkommt und wichtige Funk-tionen im Immunsystem hat. Es geh¨ort zur Familie der Enterobacteriaceae (lat.
enteron: Darm). Weiter geh¨ort es zu den fakultativ anaeroben Mikroorganismen und besitzt daher die F¨ahigkeit, Energie sowohl durch Atmung als auch durch ge-mischte S¨aureg¨arung zu gewinnen. Es dient als Indikator f¨ur f¨akale Verunreinigun-gen, beispielsweise von Wasser. Es veranlasst ein dauerndes Training des Mukosa-Immunsystems und f¨ordert die Produktion von sekretorischem Immunglobulin A.
Weiterhin produziert es Vitamin K. In Abbildung 7.4 B ist die umgebende Membran der Gram-negativen Bakterien schematisch dargestellt. Neben der Plasmamembran
KAPITEL 7. SINGULETT-SAUERSTOFF-INTERAKTION MIT ZELLEN UND BAKTERIEN
besitzen diese Bakterien auch eine Zellwand, welche hier zwischen 10 und 15 nm dick ist. E. coli besitzt eine d¨unne, innere Zellwand bestehend aus 2 - 3 Schichten von Peptidoglykanen, einem periplasmatischen Raum und eine ¨außere bilamin¨are Lipidmembran. Die ¨außere Doppelmembran besteht auf der Innenseite aus Phos-pholipiden, die ¨uber Lipoproteine mit der angrenzenden bilamin¨are Lipidmembran verbunden sind. Die Außenseite besteht aus Lipopolysacchariden und Porinen (Tun-nelproteine).
In Tabelle 7.1 sind noch einmal die wichtigsten Unterschiede der vier verschiedenen Zelltypen dargestellt.
Prokaryoten Eukaryoten
S. Aureus E. Coli HT29 NHEK
Gr¨oße 1µm 3 µm 20-30µm
Eigenschaften Gram-positiv Gram-negativ proteinarme Membran
Gene 2334 4288 ca. 30.000
Vielzelligkeit - +
Kern - +
Organellen - +
Tabelle 7.1: Ubersicht ¨uber die Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen¨