3. Material und Methoden
3.2. Samengewinnung und –aufbereitung
Versuch 1
Die Samengewinnung erfolgte auf einem Phantom (Modell Celle) mithilfe einer künstlichen Scheide (Modell Hannover, Minitüb, Tiefenbach) in die ein steriles Filterpaper eingebaut wurde, um den Gel-Anteil des Ejakulats zu entfernen. Direkt im Anschluss an die Samengewinnung erfolgte die Verdünnung des Ejakulats 1 : 1 (v/v) mit körperwarmem nicht kapazitierendem Whittens- oder Tyrode-Medium.
Die dann folgende Zentrifugation des verdünnten Samens für 1 min bei 100g entfernte tote Zellen und Debris. Der Überstand wurde ein zweites Mal für 5 min bei 600 g zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde mit nicht kapazitierendem und kapazitierendem Whittens-Medium sowie mit nicht kapazitierendem und kapazitierendem Tyrode-Medium resuspendiert und auf eine Dichte von 50 x 106 /ml eingestellt. Dann inkubierten die Samenaufbereitungen bis zur Messung im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2.
Versuch 2
Die Samengewinnung erfolgte wie bei Versuch 1 beschrieben. Nach Entfernung des Gel-Anteils wurde das Volumen des Ejakulats, photometrisch die Dichte und
Material und Methoden
mikroskopisch die Motilität bestimmt und anschließend mit körperwarmem Magermilchverdünner (INRA-82 nach VIDAMENT et al. 2000, siehe Anhang) auf eine Dichte von100 x 106 /ml eingestellt und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Produktion von Tiefgefriersamen erfolgte wie bei SIEME et al. (2003) beschrieben. In groben Zügen wurde der verdünnte Samen für zehn Minuten bei 600 g zentrifugiert und das Pellet in Magermilchverdünner mit 2,5% Eidotter und Glyzerin resuspendiert. Das Ziel ist eine Endkonzentration von 2,5% Glyzerin und eine Dichte von 200 x 106 /mL. Über zwei Stunden wurde der Samen auf 5 ºC abgekühlt und dann in 0,5 ml Pailletten abgefüllt. Das Einfrieren der Pailletten erfolgte mit einer Abkühlrate von 60 ºC pro min bis auf -140 ºC und darauf folgender Lagerung in flüssigem Stickstoff.
Das Auftauen erfolgte direkt vor der Messung für 30 s bei 37 ºC im Wasserbad.
3.3. Medien
Vier verschiedene Medien wurden in der vorliegenden Arbeit miteinander verglichen.
Neben dem modifizierten Tyrode-Medium auch das neuere modifizierte Whittens-Medium (Zusammensetzung siehe Anhang). Durch Zugabe von Hydrogenkarbonat und BSA wurde jeweils ein kapazitierendes Medium hergestellt, die Kontrolle ohne Hydrogenkarbonat und BSA stellte das nicht kapazitierende Medium dar. Die Medien wurden mindestens zwei Stunden vor Versuchsbeginn bei 38 ºC im Wärmeschrank äquilibriert, die kapazitierenden Medien wurden wegen ihres Hydrogenkarbonatgehalts unter 5 % CO2 Atmosphäre inkubiert.
Als Flussmedium für das Durchflusszytometer diente steril filtriertes HBS-Medium (Zusammensetzung siehe Anhang).
3.4. Chemikalien
Versuch 1
Jede der vier Spermaaufbereitungen wurde zu vier Aliquots aufgeteilt und mit Procain (5 mmol/l Endkonzentration; Procain-hydrochlorid; Sigma-Aldrich, München), Pentoxifyllin (3,5 mmol/l; Sigma-Aldrich) und Trolox (120 mmol/l;
6-Hydroxy-2,5,7,8-Material und Methoden
tetramethylchroman-2-carboxylsäure; Sigma-Aldrich) versetzt. Ein Aliquot ohne Zusatz diente als Kontrolle.
Versuch 2
Im zweiten Versuchsteil wurde nur Procain (Procain-hydrochlorid; Sigma-Aldrich, München) eingesetzt. Zu den aufbereiteten aliquotierten Spermaproben wurde aus einer Procain-Stammlösung (100x) soviel hinzupipettiert, das folgende Endkonzentrationen erreicht wurden: 0, 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 und 8,0 mM Procain.
Anschließend wurden die Proben bis zur Messung im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 inkubiert
3.5. Durchflusszytometrie
Für die Messungen wurde das Gerät Cell Lab Quanta SC MPL (Beckman Coulter, Krefeld) genutzt. Es ist mit einem 488nm Argon-Ionenlaser zur Anregung, sowie einem 525 ± 30 nm Filter für die Detektion grüner, einem 590 ± 30 nm Filter für orange und einem ≥ 670 nm Filter für rote Fluoreszenz ausgerüstet.
Die Fließgeschwindigkeit des Flussmediums HBS wurde auf etwa 30 µl/min eingestellt und hatte eine Zählrate von 200-500 Partikeln pro Sekunde zur Folge. Pro Probe wurden 5000 Spermien gemessen. Die Auswahl der Spermien aus den Gesamtpartikeln erfolgte auf Basis des elektronischen Volumens und der Seitwärtsstreuung.
Für die Messungen am Durchflusszytometer wurden 5 µl des Magermilch-verdünnten Samens (Dichte 100 x 106/ml) mit Tyrode oder Whittens-Medium auf 500 µl Endvolumen (Enddichte 1 x 106/ml) verdünnt. Die hergestellten Aliquots inkubierten unterschiedlich lange unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2.
Zehn Minuten vor der Messung wurden die entsprechenden Farbstoffe zupipettiert.
Material und Methoden
3.5.1. FITC-PNA/PI-Messung
Zur Bestimmung des Anteils der Spermien mit intakter Plasmamembran (PMI) oder mit positivem akrosomalem Status (PAS) wurde eine Doppelfärbung mit Propidiumiodid (PI; Sigma-Aldrich, München) und mit Fluorescein-isothiocyanate markiertem Peanut-Agglutinin (FITC-PNA; Axxora, Lörrach) durchgeführt (RATHI et al. 2001).
Dazu wurden 5 µl Samen (Dichte 100 x 106/ml) in 490 µl Tyrode oder Whittens-Medium verdünnt, und sowohl 2 µl 0,75 mM PI als auch 3 µl 75 µM FITC-PNA dazupipettiert. Das Ergebnis war ein Endvolumen von 500 µl, eine Dichte von
1 x 106/ml, 3 µM PI und 0,45 µM FITC-PNA.
Material und Methoden
Entsprechend ihrer Färbung konnten im FL1/FL3-Punktediagramm die Spermien in vier Gruppen eingeteilt werden:
Plasmamembran-intakte, lebende Spermien mit negativem akrosomalen Status (PMI; PI negativ, FITC-PNA negativ),
Plasmamembran-defekte Spermien mit negativem akrosomalen Status (PI positiv, FITC-PNA negative),
Plasmamembran-defekte, nicht lebende Spermien mit positivem akrosomalem Status (PI positiv, FITC-PNA positiv) sowie
Plasmamembran-intakte, lebende Spermien mit positivem akrosomalem Status (PI negativ, FITC-PNA positiv).
Alle FITC-PNA-positiven Spermien wurden als Spermien mit positivem akrosomalem Status (PAS) klassifiziert.
Abb. 3: Punktwolkendiagramm der vier Spermienpopulationen nach FITC-PNA/PI-Färbung und anschließender durchflusszytometrischer Auswertung
Material und Methoden
Die Reaktion auf Calcium Ionophor A 23187 wurde ebenfalls mit der FITC-PNA/PI-Messung gemessen. Dazu wurden 5 µl Calcium Ionophore A 23187 (Sigma-Aldrich, München) zur Probe dazupipettiert (5 µmol/l Endkonzentration) und 60 Minuten unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 unterschiedlich lange inkubiert. Nach ihrem Verhalten im FL1/FL3-Punktediagramm wurden alle FITC-PNA-positiven Spermien als Spermien mit positivem akrosomalen Status nach Calcium Ionophore (PAS-IONO) angesehen.
3.5.2. Merocyanin 540-Messung
Die Anteile lebender kapazitierter und nicht kapazitierter Spermien wurden mit Hilfe der Merocyanin 540-Messung bestimmt.
Zu 490 µl Samen in Tyrode oder Whittens-Medium (Dichte 5 x 106/ml) wurden 5 µl Merocyanin 540 (270 µmol/l; Sigma-Aldrich, München) und 5 µl YoPro (2.5 µmol/l;
Invitrogen, Karlsruhe) pipettiert und 30 Minuten unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 inkubiert.
Nach ihrem Verhalten im FL1/FL2-Punktediagramm wurden drei Spermienpopulationen unterschieden:
Lebende, nicht kapazitierte Spermien (N-CAP; YoPro negativ, Merocyanin negativ), lebende, kapazitierte Spermien (CAP; YoPro negativ, Merocyanin positiv) sowie Plasmamembran-defekte, nicht lebende Spermien (YoPro positiv), die in der weiteren Analyse nicht weiter verwendet wurden.
3.5.3. JC-1-Messung
Die Anteile an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (HMMP) und mit niedrigem (low; LMMP) wurden mit der JC-1-Färbung bestimmt (GILLAN et al., 2005). Nach Färbung der Spermien mit 5 µl JC-1 (0,153 mmol/l) und Inkubation unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 für 20 Minuten konnten im FL2/FL1-Punktediagramm zwei Spermienpopulationen (HMMP und LMMP) unterschieden werden.
Material und Methoden