Figure legends and figures

Figure 1. Sperm motility characteristics as determined using computer assisted

sperm analysis (CASA), of stallion sperm incubated for 10 min in Tyrode A capacitation medium supplemented with increasing concentrations of procaine. A:

total (MOT) and progressive motility (PMS), B: amplitude of lateral head movement (ALH) and beat cross frequency (BCF), C: average path (DAP), curve line (DCL) and straight line distance (DSL), D: average path (VAP), curve line (VCL) and straight line velocity (VSL), as well as linearity (VSL/VCL). Averages ± standard deviations of three ejaculates of each of six stallions are presented.

Figure 2. Curve line velocity (VCL; closed squares) and amplitude of lateral head

movement (ALH; open squares) for sperm from different stallions (A: H1, B: H3, C:

H4, D: H5, E: H6, F: H9), that was incubated for 10 min in Tyrode A capacitation medium supplemented with increasing concentrations of procaine. Averages ± standard deviations of three ejaculates are presented.

Figure 3. In vitro capacitation properties of sperm from different stallions (A: H1, B:

H3, C: H4, D: H5, E: H6, F: H9). Sperm was incubated in Tyrode A capacitation medium, and a PI/FITC-PNA double staining was performed for aliquots at different time points after which samples were analyzed flow cytometrically. Percentages of plasma and acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA negative;

closed black squares), plasma membrane damaged cells (PI positive; open squares),

Ergebnisse

and acrosome damaged cells (FITC-PNA positive; closed gray squares) are plotted as a function of the incubation time under capacitating conditions. Averages ± standard deviations of three ejaculates are presented.

Figure 4. In vitro capacitation properties for stallion sperm incubated in Tyrode A

capacitation medium (A) or Tyrode B control medium (B). Percentages of plasma and acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA negative; closed black squares), plasma membrane damaged cells (PI positive; open squares), and acrosome damaged cells (FITC-PNA positive; closed gray squares) are plotted as a function of the incubation time. Averages ± standard deviations of three ejaculates of each of five stallions are presented.

Figure 5. In vitro capacitation properties for stallion sperm incubated in Whittens A

capacitation medium (A-B) or Whittens B control medium (C-D), in the absence (A, C) and presence (B, D) of 5 mM procaine. Percentages of plasma and acrosomal membrane intact viable cells (PI negative/FITC-PNA negative; closed black squares), plasma membrane damaged cells (PI positive; open squares), and acrosome damaged cells (FITC-PNA positive; closed gray squares) are plotted as a function of the incubation time. Averages ± standard deviations of one ejaculate of each of five stallions are presented.

Figure 6. Curve line velocity (A) and amplitude of lateral head movement (B) for

stallion sperm incubated in Whittens A capacitation medium (closed symbols) or Whittens B control medium (open symbols), for 90 min, in the absence (squares) and

Ergebnisse

presence (circles) of 5 mM procaine. Averages ± standard deviations of one ejaculate of each of five stallions are presented.

Figure 7. Sperm motility characteristics of cryopreserved sperm that was thawed and

diluted in Tyrode A capacitation medium supplemented with increasing concentrations of procaine. Samples were incubated under capacitating conditions for 10 min at 37 ^oC, after which CASA analysis was performed. A: total (MOT) and progressive motility (PMS), B: amplitude of lateral head movement (ALH) and beat cross frequency (BCF), C: average path (DAP), curve line (DCL) and straight line distance (DSL), D: average path (VAP), curve line (VCL) and straight line velocity (VSL), as well as linearity (VSL/VCL). Averages ± standard deviations of one ejaculate of each of four stallions are presented.

Ergebnisse

amplitude of lateral head movement (µm)

0

Ergebnisse

Ergebnisse

-Ergebnisse

Ergebnisse

-Ergebnisse

Figure 6.

time (min)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

amplitude of lateral head movement (µm)

0

Ergebnisse

amplitude of lateral head movement (µm)

0

Diskussion

5. Diskussion

Bis heute ist die Nutzung der Möglichkeiten der IVF beim Pferd begrenzt. Ein Grund ist die bisher nicht zuverlässige Kapazitation der equinen Spermatozoen.

Während im ersten Teil der vorliegenden Studie noch Tyrode-Medium und Whittens-Medium verglichen wurden und drei verschiedene Substanzen auf ihre Fähigkeit zur Auslösung der Kapazitation und/oder Hyperaktivität der Hengstspermien untersucht wurden, konzentriert sich der zweite Teil basierend auf den vorherigen Ergebnissen nur auf Whittens-Medium und Procain. Diese Kombination verspricht laut Literatur auch gute Ergebnisse im equinen IVF (McPARTLIN et al. 2008, 2009).

Bei der initialen durchflusszytometrischen PI/FITC-PNA-Messung zeigten Whittens- und Tyrode-Medium keine Unterschiede im Anteil der Spermien mit positivem akrosomalen Status. Dies spricht für die grundsätzliche Eignung beider Medien für die Verdünnung von Hengstsperma. Die positive akrosomale Reaktion der Spermien auf Calcium Ionophor A 23187 ist in kapazitierender Tyrode-Lösung deutlich stärker als in kapazitierendem Whittens-Medium (cap MT 45.8 ± 20.0% versus noncap MW 17.9 ± 8.7%, cap MW 21.8 ± 5.5%, noncap MT 26.5 ± 9.0%; P < 0.05; Versuch 1:

Fig. 1d). Diese Beobachtung deckt sich mit der von McPARTLIN et al. (2008), die eine Reaktion der Spermien auf Calcium Ionophor A 23187 in kapazitierendem Whittens-Medium erst nach sechsstündiger Inkubation sahen.

Dem gegenüber steht der größere Anteil Merocyanin-positiver Zellen in kapazitierendem Whittens-Medium (cap MW 34.7 ± 14.7% versus noncap MW 5.7 ± 4.9%, noncap MT 6.7 ± 9.9%, cap MT 9.0 ± 5.9%; P < 0.05; Versuch 1: Fig. 1e).

Diese Wirkung wurde schon nach der kurzen Inkubationszeit von 30 Minuten deutlich. Offen bleibt, ob kapazitierendes Whittens-Medium zu einer insgesamt langsameren Kapazitation führt und deshalb die im Merocyanin-Assay gefundenen mit den frühen Stufen der Kapazitation einhergehenden Veränderungen deutlicher werden als in Tyrode-Medium.

Beide Medien eignen sich somit für die Kapazitation von Hengstsperma, je nach Messmethode zur Bestimmung der durchlaufenen Kapazitation bestehen jedoch Unterschiede.

Diskussion

Wie sich in den Versuchen zeigte, ist der Vorteil von Whittens- gegenüber Tyrode-Medium die bessere Konservierung der Spermien, was sich sowohl in einem größeren Anteil Plasmamembran-intakter Spermien (PI negativ) als auch in einem höheren Anteil an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (HMMP) objektivieren lässt. Die Zugabe von Procain zeigt tendenziell eine stärkere Reaktion der Spermien in kapazitierendem Whittens-Medium.

Die Zugabe von Procain löst praktisch sofort das typische kreisförmige, bei genauerer Betrachtung Stern-ähnliche Bewegungsmuster hyperaktiver Hengstspermien aus.

Mit Hilfe der Computer-assistierten Spermienanalyse lassen sich die veränderten Parameter objektiv benennen. Neben einem Anstieg der Werte für VCL, DCL und ALH kommt es zu einem Abfall der Werte für VSL, DSL, BCF sowie der berechneten Werte STR und LIN und dem Anteil der progressiv motilen Spermien, während die Gesamtmotilität nicht verändert wird. Ebenfalls verändert die Zugabe von Procain weder den Anteil Plasmamembran-intakter (PI negativer) Zellen noch wird im Durchflusszytometer eine Kapazitation der Spermien beobachtet.

Interessanterweise löst Procain diese Reaktion sowohl in kapazitierendem als auch nicht kapazitierendem Medium aus, führt dabei nicht zu einem erhöhten Anteil kapazitierter Spermien und stärkt damit die Argumentation, dass Kapazitation und Hyperaktivität voneinander unabhängig reguliert sind (MARQUEZ und SUAREZ 2004, zusammengefasst von SUAREZ 2008). MARQUEZ und SUAREZ (2004) lösten mit chemischen Substanzen hyperaktive Bewegungsmuster in unkapazitierten Bullenspermien aus, konnten andererseits keine Hyperaktivität in kapazitierendem Medium beobachten.

Im zweiten Versuchsteil konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Procain konzentrationsabhängig ist und durchschnittlich bei 5mM Endkonzentration die beste Dosierung liegt. Allerdings unterliegt die Reaktion der Spermien auf das Procain wie auch der Ablauf der Kapazitation individuellen Einflüssen. So zeigen einzelne Hengste schon bei geringerer Dosierung die beste Reaktion in Form einer erhöhten VCL und ALH, sodass wahrscheinlich vor einem IVF-Versuch die individuelle Dosis erforscht werden sollte. Bei der Messung von aufgetautem Tiefgefriersamen fällt auf, dass durchschnittlich höhere Dosen nötig sind. Da der genaue

Diskussion

Wirkungsmechanismus des Procains noch nicht genau bekannt ist, erfordert die Klärung dieser Beobachtung weitere Forschung.

Die Zugabe von Pentoxifyllin führt unabhängig vom Medium zu einem erhöhten Anteil kapazitierter Spermien in der Merocyanin-Färbung (P < 0.05; Versuch 1: Fig.

2a–d) ohne jedoch zu hyperaktiven Bewegungsmustern zu führen. Auch dies spricht wieder für eine voneinander unabhängig Regulation von Kapazitation und/oder Hyperaktivierung (MARQUEZ und SUAREZ 2004; zusammengefasst von SUAREZ, 2008). Jedoch konnte der an menschlichem Sperma beschriebene positive Einfluss auf die Akrosomreaktion (GAVELLA et al. 1991; TESARIK et al. 1992) im PI/FITC-PNA-Assay auch nach Calcium Ionophor A 23187 nicht beobachtet werden. Die bei der Behandlung des Mannes beobachtete bessere Motilität und den erhöhten Anteil hyperaktiver Spermien (YOVICH, 1993) konnten wir beim Hengst ebenfalls nicht bestätigen.

Etwas enttäuschend war die Zugabe von Trolox. Weder in der Computer-assistierten Spermienanalyse noch in den durchflusszytometrischen Messungen konnte eine Wirkung hinsichtlich Kapazitation und/oder Hyperaktivierung der Samenzellen beobachtet werden.

Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen in Übereinstimmung mit McPARTLIN et al.

(2008, 2009) die Vorteile der Kombination kapazitierendes Whittens-Medium/Procain zur Kapazitation und Hyperaktivierung von Hengstspermien. Alternativ wäre die gleichzeitige Behandlung mit Pentoxifyllin und Procain zu überlegen.

Wie die durchflusszytometrische Messung zeigt (Versuch 1: Fig. 5), entwickelt kapazitierendes Whittens-Medium schon nach 20 Minuten seine Wirkung. Da sich die Wirkung des Procains direkt bei Zugabe entwickelt, wird eine längere Vorinkubation der Spermien unnötig, so dass die Lebensfähigkeit der Spermatozoen für die IVF erhalten bleibt. Die Wirkung dieser Aufbereitung auf die Eizelle ist noch nicht bekannt, jedoch spricht eine IVF-Rate von 60,7 % (McPARTLIN et al., 2009) für sich.

Zusammenfassung

6. Zusammenfassung

Florian Ortgies (2011):

Untersuchungen zur Kapazitation und Hyperaktivierung equiner Spermatozoen Ziel der Dissertation war es, den Einfluss verschiedener Medien und Chemikalien auf die Kapazitation und Hyperaktivierung von Hengstspermien mit Hilfe der computer-assistierten Spermienanalyse und der Durchflusszytometrie zu erforschen. Dazu wurden zwei Versuchsteile durchgeführt. Im ersten Versuchsteil wurden kapazitierendes und nicht kapazitierendes Tyrode-Medium und kapazitierendes und nicht kapazitierendes Whittens-Medium, sowie der Effekt von Procain, Pentoxifyllin und Trolox getestet. Dabei zeigte sich in beiden kapazitierenden Medien eine rasche Reaktion der Spermien, die im Kontrollmedium ausblieb. Procain führte unabhängig vom Medium sehr schnell zu einer Hyperaktivierung der Spermien, während durch Pentoxifyllin die Kapazitation ausgelöst wurde. Trolox zeigte keinen Effekt.

Im zweiten Versuchsteil wurde die individuelle Reaktion des Spermas von sechs verschiedenen Hengsten auf ansteigende Procainkonzentrationen in Tyrode-Medium näher untersucht. Dabei wurde auch tiefgefrorenes Sperma verwendet.

Eine Konzentration von 5mM Procain führte verlässlich zu einer Hyperaktivierung, jedoch konnte gezeigt werden, dass einzelne Hengste schon auf eine deutlich geringere Konzentration mit hyperaktiver Bewegung reagieren. Deutlich wurde außerdem, dass TG-Samen für die Hyperaktivierung eine tendenziell höhere Konzentration an Procain benötigt.

Summary

7. Summary

Florian Ortgies (2011):

Investigation on capacitation and hyperactivation of equine spermatozoa

The objective of the thesis was to determine the effect of different media and treatments on capacitation and hyperactivation of equine spermatozoa. Sperm were measured flowcytometrically and by computer-assisted sperm-analysis.

The first study evaluated capacitating and non-capacitating Tyrode-medium and capacitating and non-capacitating Whittens-medium als well as the effect of procaine, pentoxifylline and Trolox. Both capacitating media led to sperm capacitation that was not seen in control media. Independent of the medium procaine almost immediately induced hyperactivation, while pentoxifylline caused capacitation. Trolox showed no effect.

The second study further examined the individual response of spermatozoa from six different stallions on increasing procaine concentrations in Tyrode medium. This was also performed on frozen/thawed semen.

A concentration of 5mM procaine reliably caused hyperactivation, but it was demonstrated that hyperactivation can be induced with far lower concentrations in individual stallions. Additionally, a higher procaine concentration is needed to induce hyperactivation in frozen/thawed semen.

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Im Dokument Untersuchungen zur Kapazitation und Hyperaktivierung equiner Spermatozoen (Seite 48-79)