Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur
Kapazitation und Hyperaktivierung equiner Spermatozoen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Florian Ortgies
Hannover
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Sieme Klinik für Pferde
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Sieme 2. Gutachter: Prof. Dr. C. Wrenzycki
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2011
Meiner Familie und Christin
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 2
2.1. Spermatogenese und Fertilisation 2
2.2. Kapazitation und Hyperaktivität 4
2.3. Medien und Chemikalien 7
2.4. Computer-assistierte Spermienanalyse (CASA) 10
2.5. Durchflusszytometrie 11
2.6. Fluoreszenzfarbstoffe 12
3. Material und Methode 14
3.1. Tiere 14
3.2. Samengewinnung und –aufbereitung 14
3.3. Medien 15
3.4. Chemikalien 15
3.5. Durchflusszytometie 16
3.5.1. FITC-PNA/PI –Messung 17
3.5.2. Merocyanin-540-Messung 19
3.5.3. JC-1-Messung 19
3.6. Computer-assistierte Spermienanalyse (CASA) 20
3.7. Statistik 20
4. Ergebnisse 22
4.1. Chapter 1: Effect of procaine, pentoxifylline and trolox on capacitation
and hyperactivatio of stallion spermatozoa 22 4.2. Chapter 2: Procaine-induced sperm hyperactivation and in vitro
capacitation properties show differences amongst stallions 23
4.2.1. Abstract 24
4.2.2. Introduction 25
4.2.3. Materials and methods 27
4.2.3.1 Semen collection and dilution 27
4.2.3.2 Flow cytometric analysis of in vitro capacitation 28
4.2.3.3 Procaine-induced hyperactivation 30
4.2.4. Results 32
4.2.4.1 Procaine-induced hyperactivation 32 4.2.4.2. Individual variation in procaine-induced hyperactivation
and in vitro capacitation properties 32 4.2.4.3. Hyperactivation and in vitro capacitation properties
in (non-) capacitation medium supplemented with procaine 33 4.2.4.4. Procaine-induced hyperactivation of cryopreserved
stallion sperm 34
4.2.5. Dicussion 35
4.2.6. References 36
4.2.7. Figure legends and figures 40
5. Diskussion 50
6. Zusammenfasssung 53
7. Summary 54
8. Literaturverzeichnis 55
9. Abbildungsverzeichnis 66
10. Tabellenverzeichnis 68
11. Anhang 69
Abkürzungsverzeichnis
® eingetragenes Warenzeichen
TM registered Trademark ºC Temperatur in Grad Celsius
% Prozent
ALH Amplitude of Lateral Head displacement (Amplitude seitlicher Kopfauslenkung;
Strecke, die der Spermienkopf in Bewegung ausschlägt) ATP Adenosin-triphosphat
BCF Beat-cross Frequency (Frequenz, mit der der Spermienkopf in Bewegung ausschlägt) BSA bovines Serumalbumin
CaCL2 Calciumchlorid
cAMP zyklisches (cyclic) Adenosin-3',5'-monophosphat cap kapazitierend
CAP kapazitierte Spermien
CASA Computer assisted sperm analysis / Computer-assistierte Spermienanalyse CO2 Kohlenstoffdioxid
DAP Distance Average Path (Länge der geglätteten Bahn) DCL Distance Curved Line (Länge der gewundenen Strecke)
DSL Distance Straight Line (Länge der direkten Strecke zwischen Anfangs- bis Endpunkt) EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat
et al. et alii
Fig. Abbildung (figure)
FITC-PNA mit Fluorescein-isothiocyanate markiertes Peanut-agglutinin (Lektin der Erdnuss arachis hypogea)
FL 1-3 Filter Nummer 1 bis 3
g Erdbeschleunigungskraft (gravitational acceleration)
h Stunde
HBS HEPES buffered saline (siehe Anhang)
Hz Hertz
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure HMMP Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential IVF In –vitro-Fertilisation
JC-1 5,5´,6,6´-tetrachloro-1,1´,3,3´-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanin iodid KCl Kaliumchlorid
KH2PO4 Kaliumdihydroxyphosphat
L Liter
LIN Linearity (VSL/VCL)
LMMP Spermien mit niedrigem Mitochondrienmembranpotential
mg Milligramm
MgCl2 Magnesiumchlorid MgSO4 Magnesiumsulfat
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µmol Mikromol
min Minute
ml Milliliter mmol Millimol
mM Millimolar
mOsm Milliosmol MOT Gesamtmotilität
MW modifiziertes Whittens Medium MT modifiziertes Tyrode Medium
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat N-CAP nicht kapazitierte Spermien
nm Nanometer
noncap nicht kapazitierend
P Irrtumswahrscheinlichkeit (probability) PAS Spermien mit positivem akrosomalen Status
PAS-IONO Spermien mit positivem akrosomalen Status nach Behandlung mit Calcium Ionophor A 23187
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenaktivität
PI Propidiumiodid
PMI Spermien mit intakter Zellmembran PMS progressivly motile Spermien
s Sekunde
STR Staightness (VSL/VAP)
v Volumen
VAP Velocity Average Path (Geschwindigkeit auf einer geglätteten Bahn)
VCL Velocity Curved Line, kurvolineare Geschwindigkeit (Geschwindigkeit auf gewundener Strecke)
vs. versus
VSL Velocity Straight Line (Geschwindigkeit auf direkter Strecke von Anfangs- bisEndpunkt)
Einleitung
1. Einleitung
Bis heute wird die überwiegende Mehrzahl der Fohlen von der leiblichen Mutter geboren. Die Trächtigkeit wird im Regelfall durch Bedeckung im Natursprung oder Besamung der Stute erreicht. So führt der derzeit aktuellste Jahresbericht der FN für das Jahr 2009 insgesamt 48206 Bedeckungen von Reitpferdestuten an. Auf die Warmblutzucht entfallen dabei 39053 (81 %) Besamungen mit Frischsamen sowie weitere 990 Besamungen mit Tiefgefriersperma. Im Natursprung wurden 5027 Stuten gedeckt. Für den Embryotransfer wurden 431 tragende Empfängerstuten registriert.
Durch die anatomische Besonderheit des Pferdeeierstocks ist die Ovulation mehrerer Follikel (Superovulation) und damit die Freisetzung mehrerer Eizellen pro Embryotransfer zur Steigerung der Effektivität nur bedingt möglich. Das Punktieren von Follikeln und Absaugen von Oozyten an der lebenden Stute oder auch die Gewinnung von Eizellen aus frisch toten Ovarien ist mittlerweile möglich. Grundlage für die Produktion von Embryonen aus diesen Zellen ist die erfolgreiche Befruchtung der Oozyten außerhalb der Stute, die In-vitro-Fertilisation.
Um die Effektivität der Befruchtung zu erhöhen, wurden Maßnahmen wie die direkte Injektion eines Spermiums in die Eizelle (intracytoplasmatische Spermieninjektion, ICSI) oder das Zonasplitting entwickelt, die nicht nur beim Pferd, sondern auch bei anderen Tierarten und bei der Frau mit Erfolg angewandt werden. Bisher stößt die Forschung am Pferd hier an ihre Grenzen, seit den Anfängen der In-vitro- Befruchtung sind bis heute nur zwei Fohlen geboren worden (Palmer et al. 1991;
Bezard et al. 1992).
Die Forschung fokussiert sich nun auf die Seite der männlichen Gameten. Die verlässliche Endreifung (Kapazitation) von ejakulierten Hengstspermien stellt nach wie vor ein Problem dar.
Ziel der vorliegenden Arbeit soll die nähere Erforschung sowohl der Wirkung unterschiedlicher kapazitierender und nicht kapazitierender Inkubationsmedien als auch der Effekt verschiedener Chemikalien auf die Samenzelle sein. Die rasche und objektive Beurteilung einer Spermienpopulation wird dabei mit Hilfe der Flowzytometrie und der Computer-assistierten Spermienanalyse (CASA) möglich.
Literaturübersicht
2. Literaturübersicht
2.1 Spermatogenese und Fertilisation
Die Samenzelle stellt als männliche Keimzelle eine hochspezialisierte Zelle dar, deren einzige Aufgabe die Befruchtung der weiblichen Keimzelle, der Eizelle, ist.
Die Bildung der Spermien im Hoden (Spermatogenese) führt zum Verlust der meisten Zellorganellen und eines Großteils des Zytoplasmas sowie zur Reduktion des üblichen diploiden Chromosomensatzes auf einen haploiden Satz (Meiose).
Ein Ende der Zelle entwickelt eine starke Flagelle, den Spermienschwanz. An der Wurzel dieser für die Bewegung des Spermiums notwendigen Struktur sind große Mengen an Mitochondrien für die Bereitstellung der dafür erforderlichen Energie, in Form von ATP, angesiedelt.
Abb. 1: Schematische Darstellung der Spermienmorphologie anhand eines Sagittalschnittes (modifiziert nach GADELLA et al. 2001)
Plasmamembran
äußere akrosomale Membran Akrosominhalt
innere akrosomale Membran
akrosomaler Bereich
postakr.
Bereich Halsregion
Mittelstück
Hauptstück
Endstück
Kopf
Schwanz Kernmembran, den
Zellkern umschließend postakrosomale Zentriole Mitochondrien
Literaturübersicht
Weitere Reifungsvorgänge wie das Abschnüren des letzten Restes Zytoplasma, das Erlangen der Bewegungsfähigkeit und Umstrukturierungen der Plasmamembran erfolgen anschließend im Nebenhoden. Spermien im Nebenhodenschwanz sind bewegungsfähig (STOREY 1975, JOHNSON et al. 1980), zeigen jedoch bis zur Ejakulation keine Motilität. Spezifische, die Motilität hemmende Proteine wurden in der Nebenhodenflüssigkeit der Ratte gefunden (TURNER 1982, USSELMANN 1983), Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass allein der saure pH im Nebenhoden motilitätshemmend wirkt. Untersuchungen am Bullen ergaben einen pH-Wert der Nebenhodenflüssigkeit von 5,5, mit der Folge, dass auch der intrazelluläre pH der Spermien bei 6,5 – 6,6 lag (BABCOCK 1983, CARR 1984). Im Nebenhoden des Hengstes sind ähnliche Verhältnisse zu erwarten, da auch beim Hengst der Gehalt an Hydrogenkarbonat gering ist. Ejakulierter Samen enthält dagegen eine große Menge an Hydrogenkarbonat. Werden Spermien mit Seminalplasma in Berührung gebracht, zeigen sie die typische Motilität (GAGNON 1995, LUCONI und BALDI 2003).
Spermien aus dem Nebenhodenschwanz des Hengstes sind nach künstlicher Besamung in der Lage Eizellen zu befruchten (BARKER und GANDIER 1957), die Trächtigkeitsrate ist allerdings signifikant niedriger als die nach Verwendung ejakulierter Spermien (MORRIS et al. 2002).
Nach der Ejakulation sind im weiblichen Genitaltrakt weitere Vorgänge zur Erlangung der Befruchtungsfähigkeit nötig, die als Kapazitation bezeichnet werden (AUSTIN 1951, CHANG, 1952, AUSTIN 1960, YANAGIMACHI 1994; HARRISON 1996).
In ihrer Gesamtheit versetzt erst die Kapazitation das Spermium in die Lage, im Eileiter zu überleben und ein Reservoir zu bilden, sich vom Eileiter zu lösen, sich durch den Eileiter zu bewegen und nach Durchdringen der Kumuluszellen an die Zona pellucida zu binden und die Eizelle zu befruchten (SUAREZ 2008). Die Zona pellucida stellt eine Glycoproteinhülle dar, die die Eizelle umgibt. Dort durchläuft das Spermium die Akrosomreaktion, bei der die Plasmamembran mit der äußeren Akrosommembran verschmilzt und hydrolytische Enzyme freigesetzt werden. Nach Penetration der Zona pellucida löst das Spermium in der Oozyte die kortikale Reaktion aus, die das Eindringen weiterer Spermien verhindert und gibt das Signal
Literaturübersicht
für die Vollendung der Meiose der Eizelle (2. Reifeteilung). Nach Verschmelzung des dekondensierten Spermienkopfes mit der haploiden Oozyte und der Kombination der paternalen und maternalen Chromosomensätze wird die nun wieder diploide Zelle Zygote genannt.
Die zur Kapazitation führenden Vorgänge verkürzen die Überlebenszeit des betroffenen Spermiums erheblich. Dabei ist zu beachten, dass selbst innerhalb eines Ejakulats verschiedene Spermienpopulationen existieren, die unterschiedlich schnell die Kapazitation beginnen und durchlaufen. Dies stellt im weiblichen Genitaltrakt einen Vorteil dar, da auf diese Weise über einen Zeitraum immer frisch kapazitierte Spermatozoen für die Befruchtung der Oozyte zur Verfügung gestellt werden.
Während die Technik der In-vitro-Fertilisation (IVF) bei der Frau und beim Rind erfolgreich angewendet wird, sind im equinen IVF bisher nur zwei Fohlen geboren worden (PALMER et al. 1991, BEZARD et al. 1992).
Mit Hilfe der intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) kann die Kapazitation durch mechanische Hilfe teilweise umgangen werden. Ejakulierte oder anderweitig gewonnene Spermien werden dabei mit einer Hohlnadel direkt in die Eizelle injiziert (HINRICHS 2005, GALLI und LAZZARI 2008).
2.2. Kapazitation und Hyperaktivität
Die Reifungsvorgänge der Spermien im weiblichen Genitale werden insgesamt als Kapazitation bezeichnet (YANAGIMACHI 1994, HARRISON 1996). Dies beinhaltet neben Veränderungen der Struktur der Plasmamembran (HARRISON und GADELLA 2005), die die Spermien zur Erkennung und Interaktion mit der Eizelle befähigen (GADELLA und VAN GESTEL 2004), Veränderungen im Spermienstoffwechsel sowie letztlich die hyperaktive Beweglichkeit (SUAREZ 2008).
Die Plasmamembran jedes Spermiums stellt eine Lipiddoppelschicht dar, in die Phospholipide asymmetrisch eingelassen sind. Während die innere Schicht einen hohen Anteil an Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin besitzt, enthält die äußere Schicht große Mengen an Sphingomyelin und Phosphatidylcholin (WANG et al. 2004).
Literaturübersicht
Die wichtige Rolle von Hydrogenkarbonat bei der Regulation der Motilität liegt wahrscheinlich in der Erhöhung der intrazellulären pH-Wertes durch Diffusion über die Zellmembran und der Aktivierung der cAMP-Produktion sowie der Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran für Calcium-Ionen (YANAGIMACHI 1969, SUAREZ und HO 2003). Während im Nebenhoden eine Hydrogenkarbonatkonzentration von 3-4 mM gemessen wurde, liegt Hydrogenkarbonat im Eileiter in einer deutlich höheren Konzentration von 20 mM vor (HARRISON et al. 1996, RODRIGUEZ- MARTINEZ et al. 2001, GADELLA und VAN GESTEL 2004).
Durch die erhöhte intrazelluläre Hydrogenkarbonatkonzentration wird eine im Zytosol gelegene Adenylatzyklase aktiviert, die die Menge des second messengers cAMP erhöht und dadurch zur Protein Tyrosin-Phosphorylierung über die Proteinkinase A (PKA) führt (Abb. 2).
Dabei wird auch das spermienspezifische Enzym Scramblase aktiviert, das die Membranarchitektur der Spermatozoen in größere Unordnung versetzt, destabilisiert, welches zum Herauslösen von Cholesterin führt (CROSS 1998, VISCONTI und KOPF 1998, GADELLA und HARRISON 2000, HARRISON und MILLER, 2000, FLESCH et al., 2001, GADELLA et al., 2001, BREWIS et al. 2005, HARRISON und GADELLA 2005).
Die Entfernung von Cholesterin führt zu einer erhöhten Membranfluidität der Spermien, so dass einerseits die Fusionsbereitschaft der Zellmembran mit der äußeren akrosomalen Membranen im Rahmen der Akrosomreaktion als auch die Bindung an die Zellmembran der Oozyte ermöglicht wird (LANDIM-ALVARENGA et al. 2001 Abb. 2). Die damit einhergehende Instabilität hat allerdings einen negativen Einfluss auf die Überlebenszeit der Spermien. Der Cholesterinefflux erfolgt durch Cholesterinakzeptoren wie Albumin oder Lipoproteinen im umgebenden Milieu (CROSS 1998). Die genaue Regulation ist bisher noch nicht vollständig geklärt. In vitro enthalten in den vorliegenden Versuchen sowohl kapazitierendes Tyrode- als auch Whittens-Medium bovines Serumalbumin, das als Sterolakzeptor wirkt.
Ein wichtiges Merkmal kapazitierter Spermien ist die Ausbildung eines hyperaktiven Bewegungsmusters.
Literaturübersicht
Sowohl für die Kapazitation als auch für die Ausbildung der Hyperaktivität wird ein Medium benötigt, dass Calcium (BALDI et al. 1991, PARRISH et al., 1999, HO und SUAREZ 2003) oder Hydrogenkarbonat (BOATMAN und ROBBINS 1991, GADELLA und HARRISON 2000, FLESCH et al. 2001) zur Verfügung stellt, sowie die Aktivierung der cAMP-Synthese ermöglicht (GADELLA und HARRISON 2002, HESS et al. 2005, XIE et al. 2006). Während HARRISON (1996) für Säugetierspermien annimmt, dass die Fähigkeit zur Hyperaktivität während der Kapazitation erlangt wird, weisen neuere Ergebnisse (MARQUEZ und SUAREZ 2004) auf eine unabhängig von der Kapazitation regulierte Hyperaktivität hin (zusammengefasst von SUAREZ, 2008).
Als Hyperaktivität wird ein sich deutlich von der gleichmäßigen und geradlinigen Bewegung frisch ejakulierter Spermien unterscheidendes Bewegungsmuster bezeichnet (SUAREZ und HO 2003; TURNER 2006). Die Hyperaktivität ist durch eine stärkere Krümmung des Spermienschwanzes mit einem asymmetrischen, peitschenden Geißelschlag gekennzeichnet, die unter einem Deckglas zu einem eher zirkulären Bewegungsmuster führt (SUAREZ et al. 1993; SUAREZ u. HO 2003).
Abb. 2: Schematische Darstellung einiger mit der Kapazitation verbundener Vorgänge an der Zellmembran
[entnommen aus: VARNER und JOHNSON (2011)]
Literaturübersicht
2.3. Medien und Chemikalien
Tyrode-Medium wird in verschiedenen Abwandlungen schon lange in der Zell- und Gewebeforschung eingesetzt. Auch in der spermatologischen Forschung und Diagnostik ist es weit verbreitet. So ist TALP (Tyrode-Albumin-Laktat-Pyruvat) das bei Bullen am häufigsten verwendete Medium, HARRISON et al. (1993, 1996) erforschten mit einer Tyrode-basierten Lösung die Kapazitation von Eberspermien und auch RATHI et al. (2001) griffen bei der Entwicklung des Merocyanin-Assays darauf zurück. McPARTLIN et al. (2008) entwickelten ein modifiziertes Whittens- Medium, dass die Kapazitation von Hengstspermien unterstützen oder auslösen soll.
Procain ist ein Lokalanästhetikum, das bei unterschiedlichen Säugetierspermien Hyperaktivität auslöst. Beim Meerschweinchen beobachteten MUJICA et al. (1994) durch Procain eine Verdopplung der ATP-Konzentration und einen Anstieg des second messengers cAMP in Spermatozoen in einem glucosehaltigem Medium im Vergleich zu einem zuckerfreien Medium.
Auch bei Hengstspermien führt Procain zu Hyperaktivität, allerdings sahen McPARTLIN et al. (2009) keinen Einfluss auf die Protein Tyrosin-Phosphorylierung oder die Akrosomreaktion. Durch die Verbindung mit dem Hyperaktivität auslösenden Procain mit kapazitierendem Whittens-Medium erreichten McPARTLIN et al. (2008, 2009) bei der IVF einen hohen Anteil befruchteter Pferdeeizellen (60,7 %).
Der Phosphodiesterasehemmer Pentoxifyllin wurde und wird erfolgreich in der Humanmedizin eingesetzt. Bei Patienten mit Oligoasthenospermie beobachtete YOVICH (1993) bei Einsatz von Pentoxifyllin eine signifikant erhöhte Oozytenbefruchtungs- und Embryogewinnungsrate. Behandelte menschliche Spermien zeigen eine bessere Motilität und einen erhöhten Anteil hyperaktiver Spermien. Außerdem soll Pentoxifyllin die Akrosomreaktion positiv beeinflussen und als Antioxidans wirken (GAVELLA et al. 1991).
Der Einsatz von verschiedener Antioxidantien ist beschrieben an Tiefgefriersamen vom Bullen (BECONI et al. 1993), Eber (CEROLINI et al. 2000; PEŇA et al. 2003), Schafbock (MAXWELL und STOJANOV 1996), Mann (ASKARI et al. 1994) und Frischsperma vom Hengst (AURICH et al. 1997; BALL et al. 2001).
Literaturübersicht
Der Effekt von Pentoxifyllin und dem Antioxidans Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylsäure) auf Tiefgefriersamen vom Hengst wurde von SILVA et al. (2009) untersucht. Während Pentoxifyllin keinen Einfluss auf die Motilität hatte, erhielt Trolox die Motilität auch nach zweistündiger Inkubation. Trolox ist ein wasserlösliches Vitamin E-Analogon mit einer starken antioxidativen Wirkung (MICKLE und WEISEL 1993). Laut AITKEN et al. (1989) gehen viele Fälle gestörter Spermienfunktion mit erhöhten Werten freier Radikale einher. Diese könnten zur Peroxidation der ungesättigten Fettsäuren in der Akrosommembran und folgend zum Verlust der Reaktivität auf den die Akrosomreaktion auslösenden Calciumeinstrom führen. Trolox wurde bereits als Antioxidans beim Einfrieren von Ebersamen und für Frischsamen vom Hengst genutzt. Während der Einsatz von Trolox im Einfrierprozess positive Auswirkungen auf die Motilität des aufgetauten Eberspermas hat (PEŇA et al. 2003), hatte es keine signifikante Wirkung auf die Motilität von auf 5˚C gekühltem Hengstsperma (BALL et al. 2001). Bisher scheinen keine Untersuchungen auf die Wirkung von Trolox auf Kapazitation oder Hyperaktivität vorzuliegen.
Literaturübersicht
Tabelle 1: Biomarker für die Kapazitation
[modifiziert nach VARNER und JOHNSON (2011)]
Messprinzip Methode Farbstoff Quelle
Membranlipide in größerer Unordnung
Durchflusszytometrie Merocyanin 540 1, 2
Umverteilung der Hyaluronidase
Fluoreszenzmikroskopie Immunfluoreszenz 3
Verteilung von membranständigen Lektinrezeptoren
Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszierende Lektine
4, 5, 6
Cholesteringehalt der Zellmembran
Fluoreszenzanisotrophie oder Luminiszenz-
Spektrophotometrie oder Fluoreszenzmikroskopie
1,6-Diphenyl-1,3,5- hexatrien oder Filipin
5, 7, 8, 9
Laterale Beweglichkeit der Membranlipide
Wiedererlangen der Fluoreszenz nach Bleichen (FRAP) oder Spektrophotometrie oder Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszierende Lipide
10, 11
Membranpotential Spektrofluometrie DiSC3(5) 12, 13 Tyrosinphosphorylie-
rung
Immunelektrophorese oder Immunoblotting oder Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie
Monoklonale Antikörper gegen Phosphotyrosin
12, 14, 15, 16
Aminophospholipide Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie
Annexin-V oder Ro- SA-FL
7
pH im Zytosol Spektrofluometrie BCECF-AM 17, 18
Ca2+ im Zytosol Durchflusszytometrie oder Spektrofluometrie
FURA-2 oder Fluo3- AM
13, 19, 20, 21, 22
Literaturübersicht
1 = HARRISON et al. 1996, 2 = RATHI et al. 2001, 3 = MEYERS und ROSENBERGER 1999, 4 = JIMINEZ et al. 2003, 5 = CROSS 2003, 6 = BENOFF 1997, 7 = GADELLA und HARRISON 2002, 8 = COLENBRANDER et al. 2002, 9 = FLESCH et al. 2001, 10 = SMITH et al. 1998, 11 = GADELLA et al.
1995, 12 = PIEHLER et al. 2006, 13 = FRAIRE-ZAMORA und GONZALEZ-MARTINEZ 2004, 14 = VISCONTI et al. 1995, 15 = FLESCH et al. 1999, 16 = POMMER et al. 2003, 17 = NERI-VIDAURRI et al. 2006, 18 = GARCIA und MEIZEL 1999, 19 = LINARES-HERNANDEZ et al. 1998, 20 = BRAY et al.
2005, 21 = HARRISON et al. 1993, 22 = MAGISTRINI et al. 1997
2.4 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)
Zur Beurteilung der Spermaqualität stellt die lichtmikroskopische Beurteilung der Motilität immer noch die einfachste und schnellste Methode dar. Allerdings wird die Aussagekraft hinsichtlich einer Fertilitätsprognose unterschiedlich beurteilt. Die Aussagen verschiedener Autoren zum Zusammenhang zwischen Motilitätsergebnissen und Fertilität reichen von keiner Korrelation (DOWSETT und PATTIE 1982, VOSS et al. 1981) bis zu hohen Korrelationen (SAMPER et al. 1991).
Die Einführung der computerassistierten Spermienanalyse (CASA) durch DOTT und FOSTER (1979) führte zur Entwicklung verschiedener kommerzieller Systeme [CellSoft-System (Stroemberg Mika); IVOS, v 12.2 (Hamilton Thorne Research, Beverly, MA); SpermVision™ (Minitüb, Tiefenbach)]. Die computerassistierte Spermienanalyse bietet den Vorteil einer raschen und bei Vermeidung von Messungenauigkeiten objektiven Motilitätsbeurteilung. Zusätzlich zur visuellen Beurteilung ist mittels CASA die Messung verschiedener Geschwindigkeiten und Distanzen sowie des Bewegungsmusters der einzelnen Spermien möglich (MORTIMER 2000).
Ein Nachteil von CASA liegt in der begrenzten Eignung von Vollmilch- oder eidotterhaltigen Verdünnern, da Partikel fälschlicherweise als immotile Spermienköpfe identifiziert werden können (JASKO et al. 1988).
Zu den kinetischen Parametern zählen nach BOYERS et al. (1989) die Geschwindigkeit und Strecke über den gesamten Weg, den das Spermium zurückgelegt hat (VCL = Velocity Curve Line, µm/s; DCL = Distance Curve Line, µm), die mittlere Bahngeschwindigkeit und die mittlere Strecke auf einer geglätteten Bahn (VAP = Velocity Average Path, µm/s; DAP = Distance Average Path, µm) und die
Literaturübersicht
Geschwindigkeit und die Strecke der direkten Verbindung zwischen Anfangs- und Endpunkt (VSL= Velocity Straight Line, µm/s; DSL = Distance Straight Line µm).
Daher ergeben sich bei gleichmäßiglinearem Bewegungsmuster ähnliche Werte für VAP und VSL, während VAP bei irregulärem nicht-linearem Bewegungsmuster deutlich höher als VSL ist.
Die seitliche Kopfauslenkung (ALH = Amplitude of Lateral Head displacement) beschreibt die Amplitude der Abweichung des Kopfes vom durchschnittlichen Weg.
Die Beat-Cross-Frequency (BCF) ist die gemittelte Frequenz, mit der die Bahn der gesamten vom Spermium zurückgelegten Strecke die durchschnittliche Strecke kreuzt. Aus diesen ermittelten Werten können weitere Parameter berechnet werden.
Dazu zählt die Linearität (LIN), der Quotient aus VSL und VCL, der die Geradlinigkeit über die gesamte Strecke wiedergibt. Die Straightness (STR), VSL durch VAP, beschreibt die Geradlinigkeit des durchschnittlichen Wegs (BOYERS et al. 1989, MORTIMER et al. 1997).
Die mit Hilfe von CASA gemessenen Werte eignen sich gut zur Charakterisierung der Hyperaktivität. Die Bedeutung der Hyperaktivität für das Lösen vom Eileiterepithel, die Bewegung im Eileiter und das Durchdringen der die Eizelle umgebenden Zona pellucida wurde bereits beschrieben (zusammengefasst von SUAREZ 2008).
Hyperaktivität ist durch eine weniger progressive, asymmetrische Bewegung der Spermien mit einer erhöhten seitlichen Kopfauslenkung gekennzeichnet.
MORTIMER et al. (1998) definieren im menschlichen Ejakulat Spermien mit VCL ≥ 150 µm/s und LIN ≤ 50% und ALH ≥ 7,0 µm als hyperaktive Spermien. RATHI et al.
(2001) legten bei Hengstspermien strengere Grenzen zur Bestimmung hyperaktiver Spermien (VCL ≥ 180 µm/s und ALH ≥ 12 µm) an. Dies mag ein Grund für den relativ geringen Anteil hyperaktiver Spermien im Vergleich zu dem kapazitierter Spermien im Merocyanin-Assay sein.
2.5. Durchflusszytometrie
Die Einführung der Durchflusszytometrie in die spermatologische Untersuchung in den 1980ern hat zu einer Vielzahl an Verwendungsmöglichkeiten und Protokollen geführt (MORREL 1991; SPANÒ und EVENSON 1993). Prinzip der Messung ist das
Literaturübersicht
mehr oder weniger einzelne Durchfließen der Spermien einer Messkammer. Das Gerät erkennt vorbeifließende Zellen entweder an einer vorübergehenden Spannungsänderung oder schließt über Änderungen der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung des einfallenden Laserlichts auf Größe und Granularität der Partikel und ermöglicht so die Unterscheidung der Spermien von anderen Partikeln.
Vor der Messung werden die Spermien mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt (s.u.).
Mit Hilfe eines Lasers werden die Fluoreszenzfarbstoffe zur Fluoreszenz angeregt.
Das emittierte Licht wird elektronisch verstärkt und von Fotozellen registriert. Durch die Auswahl geeigneter Filter empfängt jeder Detektor nur Licht einer bestimmten Wellenlänge.
2.6. Fluoreszenzfarbstoffe
Durch Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes Fluorescein-isothiocyanate (FITC) an ein Lektin der Erdnuss Arachis hypogea entsteht FITC-PNA. Das Lektin (Peanut- Agglutinin) bindet an die Innenseite der äußeren akrosomalen Membran (FLESCH et al. 1998) und zeigt dadurch die Akrosomreaktion an. Bei Anregung zeigt der Fluoreszenzfarbstoff grüne Fluoreszenz.
Für den Fluoreszenzmarker Propidiumiodid (PI) stellt die intakte Zellmembran ein impermeables Hindernis dar, so dass nur membrandefekte Zellen mit PI gefärbt werden können. Propidiumiodid bindet an doppelsträngige DNA und RNA (TAS u.
WESTERNENG 1981) und emittiert nach Anregung rotes Fluoreszenzlicht.
Merocyanin 540 ist ein hydrophober gelber Fluoreszenzfarbstoff, der Zellmembranen stärker anfärbt, wenn die Zelllipide weniger geordnet vorliegen (WILLIAMSON et al.
1983). RATHI et al. (2001) nutzten diese Eigenschaft, um durch Hydrogenkarbonat ausgelöste Änderungen der Phospholipidzusammensetzung der Zellmembran während der Kapazitation darzustellen.
YoPro als grüne Gegenfärbung zu Merocyanin ist wie auch PI ein Farbstoff für den die intakte Zellmembran ein impermeables Hindernis darstellt (KAVAK et al. 2003, RATHI et al. 2001).
Literaturübersicht
Der Mitochondrienfarbstoff 5,5´,6,6´-Tetrachloro-1,1´,3,3´-tetraethylbenzimidazolyl- carbocyanin iodid (JC-1) ermöglicht die Unterscheidung von Spermien mit hohem und niedrigem Mitochondrienmembranpotential, also zwischen hochleistenden und wenig leistungsfähigen Mitochondrien. JC-1 ist ein lipophiler Farbstoff, der in alle Mitochondrien aufgenommen wird und dort grün fluoresziert. In hochleistenden Mitochondrien steigt die Menge des aufgenommenen JC-1, welches in der Organelle Aggregate formt und dann orange Fluoreszenz emittiert (GARNER et al. 1997;
GILLAN et al. 2005).
Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1. Tiere
Die Ejakulate für die vorliegende Studie wurden von bekanntermaßen fruchtbaren Hengsten (4-19 Jahre) der Rasse hannoversches Warmblut des Niedersächsischen Landgestüts Celle gewonnen (Versuchsteil 1: n = 4, je zwei Ejakulate , Versuchsteil 2: n = 6, je drei Ejakulate). Bei jedem Hengst wurde vor Beginn der Versuche mehrere Wochen lang eine tägliche Samenentnahme für den Samenversand durchgeführt. Vor und während der Experimente waren alle Hengste klinisch gesund.
Die Hengste wurden in Einzelboxen auf Stroh gehalten und dreimal täglich mit Heu und Hafer gefüttert. Frisches Wasser stand über Selbsttränken immer zur freien Verfügung.
3.2. Samengewinnung und –aufbereitung
Versuch 1
Die Samengewinnung erfolgte auf einem Phantom (Modell Celle) mithilfe einer künstlichen Scheide (Modell Hannover, Minitüb, Tiefenbach) in die ein steriles Filterpaper eingebaut wurde, um den Gel-Anteil des Ejakulats zu entfernen. Direkt im Anschluss an die Samengewinnung erfolgte die Verdünnung des Ejakulats 1 : 1 (v/v) mit körperwarmem nicht kapazitierendem Whittens- oder Tyrode-Medium.
Die dann folgende Zentrifugation des verdünnten Samens für 1 min bei 100g entfernte tote Zellen und Debris. Der Überstand wurde ein zweites Mal für 5 min bei 600 g zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde mit nicht kapazitierendem und kapazitierendem Whittens-Medium sowie mit nicht kapazitierendem und kapazitierendem Tyrode-Medium resuspendiert und auf eine Dichte von 50 x 106 /ml eingestellt. Dann inkubierten die Samenaufbereitungen bis zur Messung im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2.
Versuch 2
Die Samengewinnung erfolgte wie bei Versuch 1 beschrieben. Nach Entfernung des Gel-Anteils wurde das Volumen des Ejakulats, photometrisch die Dichte und
Material und Methoden
mikroskopisch die Motilität bestimmt und anschließend mit körperwarmem Magermilchverdünner (INRA-82 nach VIDAMENT et al. 2000, siehe Anhang) auf eine Dichte von100 x 106 /ml eingestellt und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Produktion von Tiefgefriersamen erfolgte wie bei SIEME et al. (2003) beschrieben. In groben Zügen wurde der verdünnte Samen für zehn Minuten bei 600 g zentrifugiert und das Pellet in Magermilchverdünner mit 2,5% Eidotter und Glyzerin resuspendiert. Das Ziel ist eine Endkonzentration von 2,5% Glyzerin und eine Dichte von 200 x 106 /mL. Über zwei Stunden wurde der Samen auf 5 ºC abgekühlt und dann in 0,5 ml Pailletten abgefüllt. Das Einfrieren der Pailletten erfolgte mit einer Abkühlrate von 60 ºC pro min bis auf -140 ºC und darauf folgender Lagerung in flüssigem Stickstoff.
Das Auftauen erfolgte direkt vor der Messung für 30 s bei 37 ºC im Wasserbad.
3.3. Medien
Vier verschiedene Medien wurden in der vorliegenden Arbeit miteinander verglichen.
Neben dem modifizierten Tyrode-Medium auch das neuere modifizierte Whittens- Medium (Zusammensetzung siehe Anhang). Durch Zugabe von Hydrogenkarbonat und BSA wurde jeweils ein kapazitierendes Medium hergestellt, die Kontrolle ohne Hydrogenkarbonat und BSA stellte das nicht kapazitierende Medium dar. Die Medien wurden mindestens zwei Stunden vor Versuchsbeginn bei 38 ºC im Wärmeschrank äquilibriert, die kapazitierenden Medien wurden wegen ihres Hydrogenkarbonatgehalts unter 5 % CO2 Atmosphäre inkubiert.
Als Flussmedium für das Durchflusszytometer diente steril filtriertes HBS-Medium (Zusammensetzung siehe Anhang).
3.4. Chemikalien
Versuch 1
Jede der vier Spermaaufbereitungen wurde zu vier Aliquots aufgeteilt und mit Procain (5 mmol/l Endkonzentration; Procain-hydrochlorid; Sigma-Aldrich, München), Pentoxifyllin (3,5 mmol/l; Sigma-Aldrich) und Trolox (120 mmol/l; 6-Hydroxy-2,5,7,8-
Material und Methoden
tetramethylchroman-2-carboxylsäure; Sigma-Aldrich) versetzt. Ein Aliquot ohne Zusatz diente als Kontrolle.
Versuch 2
Im zweiten Versuchsteil wurde nur Procain (Procain-hydrochlorid; Sigma-Aldrich, München) eingesetzt. Zu den aufbereiteten aliquotierten Spermaproben wurde aus einer Procain-Stammlösung (100x) soviel hinzupipettiert, das folgende Endkonzentrationen erreicht wurden: 0, 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 und 8,0 mM Procain.
Anschließend wurden die Proben bis zur Messung im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 inkubiert
3.5. Durchflusszytometrie
Für die Messungen wurde das Gerät Cell Lab Quanta SC MPL (Beckman Coulter, Krefeld) genutzt. Es ist mit einem 488nm Argon-Ionenlaser zur Anregung, sowie einem 525 ± 30 nm Filter für die Detektion grüner, einem 590 ± 30 nm Filter für orange und einem ≥ 670 nm Filter für rote Fluoreszenz ausgerüstet.
Die Fließgeschwindigkeit des Flussmediums HBS wurde auf etwa 30 µl/min eingestellt und hatte eine Zählrate von 200-500 Partikeln pro Sekunde zur Folge. Pro Probe wurden 5000 Spermien gemessen. Die Auswahl der Spermien aus den Gesamtpartikeln erfolgte auf Basis des elektronischen Volumens und der Seitwärtsstreuung.
Für die Messungen am Durchflusszytometer wurden 5 µl des Magermilch-verdünnten Samens (Dichte 100 x 106/ml) mit Tyrode oder Whittens-Medium auf 500 µl Endvolumen (Enddichte 1 x 106/ml) verdünnt. Die hergestellten Aliquots inkubierten unterschiedlich lange unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2.
Zehn Minuten vor der Messung wurden die entsprechenden Farbstoffe zupipettiert.
Material und Methoden
3.5.1. FITC-PNA/PI-Messung
Zur Bestimmung des Anteils der Spermien mit intakter Plasmamembran (PMI) oder mit positivem akrosomalem Status (PAS) wurde eine Doppelfärbung mit Propidiumiodid (PI; Sigma-Aldrich, München) und mit Fluorescein-isothiocyanate markiertem Peanut-Agglutinin (FITC-PNA; Axxora, Lörrach) durchgeführt (RATHI et al. 2001).
Dazu wurden 5 µl Samen (Dichte 100 x 106/ml) in 490 µl Tyrode oder Whittens- Medium verdünnt, und sowohl 2 µl 0,75 mM PI als auch 3 µl 75 µM FITC-PNA dazupipettiert. Das Ergebnis war ein Endvolumen von 500 µl, eine Dichte von
1 x 106/ml, 3 µM PI und 0,45 µM FITC-PNA.
Material und Methoden
Entsprechend ihrer Färbung konnten im FL1/FL3-Punktediagramm die Spermien in vier Gruppen eingeteilt werden:
Plasmamembran-intakte, lebende Spermien mit negativem akrosomalen Status (PMI; PI negativ, FITC-PNA negativ),
Plasmamembran-defekte Spermien mit negativem akrosomalen Status (PI positiv, FITC-PNA negative),
Plasmamembran-defekte, nicht lebende Spermien mit positivem akrosomalem Status (PI positiv, FITC-PNA positiv) sowie
Plasmamembran-intakte, lebende Spermien mit positivem akrosomalem Status (PI negativ, FITC-PNA positiv).
Alle FITC-PNA-positiven Spermien wurden als Spermien mit positivem akrosomalem Status (PAS) klassifiziert.
Abb. 3: Punktwolkendiagramm der vier Spermienpopulationen nach FITC- PNA/PI-Färbung und anschließender durchflusszytometrischer Auswertung
Material und Methoden
Die Reaktion auf Calcium Ionophor A 23187 wurde ebenfalls mit der FITC-PNA/PI- Messung gemessen. Dazu wurden 5 µl Calcium Ionophore A 23187 (Sigma-Aldrich, München) zur Probe dazupipettiert (5 µmol/l Endkonzentration) und 60 Minuten unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 unterschiedlich lange inkubiert. Nach ihrem Verhalten im FL1/FL3-Punktediagramm wurden alle FITC-PNA-positiven Spermien als Spermien mit positivem akrosomalen Status nach Calcium Ionophore (PAS-IONO) angesehen.
3.5.2. Merocyanin 540-Messung
Die Anteile lebender kapazitierter und nicht kapazitierter Spermien wurden mit Hilfe der Merocyanin 540-Messung bestimmt.
Zu 490 µl Samen in Tyrode oder Whittens-Medium (Dichte 5 x 106/ml) wurden 5 µl Merocyanin 540 (270 µmol/l; Sigma-Aldrich, München) und 5 µl YoPro (2.5 µmol/l;
Invitrogen, Karlsruhe) pipettiert und 30 Minuten unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 inkubiert.
Nach ihrem Verhalten im FL1/FL2-Punktediagramm wurden drei Spermienpopulationen unterschieden:
Lebende, nicht kapazitierte Spermien (N-CAP; YoPro negativ, Merocyanin negativ), lebende, kapazitierte Spermien (CAP; YoPro negativ, Merocyanin positiv) sowie Plasmamembran-defekte, nicht lebende Spermien (YoPro positiv), die in der weiteren Analyse nicht weiter verwendet wurden.
3.5.3. JC-1-Messung
Die Anteile an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (HMMP) und mit niedrigem (low; LMMP) wurden mit der JC-1-Färbung bestimmt (GILLAN et al., 2005). Nach Färbung der Spermien mit 5 µl JC-1 (0,153 mmol/l) und Inkubation unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 für 20 Minuten konnten im FL2/FL1-Punktediagramm zwei Spermienpopulationen (HMMP und LMMP) unterschieden werden.
Material und Methoden
3.6. Computer-assistierte Spermienanalyse (CASA)
Für die computervideomikrographischen Motilitäts- und Viabilitätssanalysen wurde das Gerät Sperm Vision® Version 3.5 (Minitüb, Tiefenbach) verwendet. Das Gerät verfügt über ein Phasenkontrastmikroskop mit beheizbarem und automatisiertem Objekttisch. Eine beheizbare Arbeitsplatte (HT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach), die auch die Beheizung des Objekttisches steuert, steht für alle Arbeitsschritte zur Verfügung. Nach den Vorgaben der Firma Minitüb wurde für jede Messung eine 20 µm tiefe Messkammer (20 Mikron, SC 20-01-04-B, Fa. Leja, GN Nieuw-Vennep, NL) mit etwa 4 µL aufbereitetem Sperma befüllt. Über eine mit dem Mikroskop verbundene digitale Hochgeschwindigkeitskamera (60 Bilder pro Sekunde) wurden die mikroskopischen Bilder an den Computer weitergeleitet. Pro Probe wurden innerhalb von 30-45 Sekunden acht Sichtfelder und pro Feld 100 Zellen analysiert.
Das Programm errechnet aus der Positionsveränderung des Spermienkopfes in den Bildern einer Serie folgende Parameter: Gesamtmotilität (MOT, %), progressive Motilität (PMS, %), die mittlere Geschwindigkeit auf der geglätteten Bahn
(VAP, µm s-1), die Geschwindigkeit auf direkter Strecke zwischen Anfangs- und Endpunkt (VSL, µm s-1), die kurvolineare Geschwindigkeit (VCL, µm s-1), die Gradlinigkeit des gemittelten Weges - Straightness (STR = VSL/VAP), die Linearität (LIN = VSL/VCL), die Strecke der direkten Verbindung zwischen Anfangs- und Endpunkt (DSL, µm), die kurvolineare Strecke (DCL, µm), die mittlere Strecke auf einer geglätteten Bahn (DAP, µm), die Frequenz, mit der die Bahn der DCL die der DAP kreuzt = Beat cross frequency (BCF, Hz) und die Amplitude seitlicher Kopfauslenkung (ALH, µm) (zusammengefasst von MORTIMER 2000).
Ab einer mittleren Geschwindigkeit auf der geglätteten Bahn (VAP) von > 40 µm s-1 und einer Geradlinigkeit (STR) > 0,5 wurde ein Spermium als progressiv motil erkannt.
3.7. Statistik
Für die statistische Auswertung der Daten wurde das Programm „SPSS for Windows“ (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) Version 17.0 verwendet.
Material und Methoden
Die Prüfung auf Normalverteilung erfolgte mit dem Kolmogorov–Smirnov-Test. Alle Daten waren normalverteilt und wurden durch den Mittelwert und die Standardabweichung beschrieben. Die Effekte der Medien und Reagenzien wurden einer multifaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) unterzogen. Signifikante Einflüsse der Medien und Reagenzien wurden mit Hilfe des Ryan-Einot-Gabriel-Welsh-Tests (GLM mit post-hoc-Test) errechnet.
Als Signifikanzgrenze wurde bei allen Tests eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 angenommen.
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1. Chapter 1: Effect of procaine, pentoxifylline and trolox on capacitation and hyperactivation of stallion spermatozoa
Veröffentlicht im Journal Andrologia 6. Juli 2011
Ortgies, F., Klewitz, J., Görgens, A., Martinsson, G., Sieme, H. (2011):
Effect of procaine, pentoxifylline and trolox on capacitation and hyperactivation of stallion sperm.
Bisher nur im Internet: doi: 10.1111/j.1439-0272.2010.01150.x.
Summary
Reasons for low in vitro fertilization (IVF) rates in the horse include the difficulties in inducing capacitation and/or hyperactivation of stallion sperm. The aim of this study was to analyze the effect of noncapacitating and capacitating modified Whitten’s (MW) and modified Tyrode’s medium (MT) and treatment with procaine (5 mmol), pentoxifylline (3.5 mmol) and trolox (120 mmol) on motility (CASA), capacitation, acrosomal status, viability and mitochondrial membrane potential of stallion spermatozoa (n = 4). While there was no influence of MT and MW on sperm motility, a significant increase in the percentage of viable-capacitated spermatozoa was observed after incubation in capacitating MW (P < 0.05). Pentoxifylline showed no significant effect on the motility pattern but increased the proportion of live- capacitated spermatozoa (P < 0.05). Trolox had no detectable effect on either capacitation or hyperactivation. Procaine was the only agent that induced hyperactivation in terms of a reduced proportion of progressively motile spermatozoa, straight line velocity, straightness, linearity and beat-cross frequency and an increase in the amplitude of lateral head displacement (P < 0.05). The combination of capacitating Whitten’s medium and procaine showed the best results for the induction of capacitation and hyperactivation in stallion spermatozoa, this was possible even after short-term incubation.
Ergebnisse
4.2. Chapter 2: Procaine-induced sperm hyperactivation and in vitro capacitation properties show differences amongst stallions
Florian Ortgies1, Harriëtte Oldenhof1, Samantha Henke1, Jutta Klewitz1, Gunilla Martinsson2, Harald Sieme1,*
1Clinic for Horses - Unit for Reproductive Medicine, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, 2National Stud Lower Saxony, Celle, Germany
*corresponding author:
Harald Sieme
Clinic for Horses - Unit for Reproductive Medicine, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 15, D-30559 Hannover, Germany
keywords: capacitation, hyperactivation, stallion, sperm, procaine
abbreviations: IVF: in vitro fertilization
Ergebnisse
4.2.1. Abstract
In vitro induction of capacitation is one of the major challenges to overcome for increasing success rates in equine in vitro fertilization. In addition, hyperactivation is needed for penetration of the zona pellucida. In this study we analyzed the effect of increasing concentrations of procaine on equine sperm hyperactivation and in vitro capacitation. Special attention was paid to variation in responses amongst sperm from individual stallions. Hyperactivation was induced under capacitating as well as non-capacitating conditions, using two types of capacitation medium (Tyrode and Whittens medium). Furthermore, it was tested if cryopreserved sperm responded to procaine in a similar fashion as diluted sperm. Induction of hyperactivation was quantified as increased sperm curve line velocity and lateral head movement, as determined using computer assisted sperm analysis. Procaine concentrations of 2.5 to 5 mM resulted in maximal hyperactivation, although great variation was observed amongst sperm from different stallions. For cryopreserved sperm, higher procaine concentrations were needed for attaining a similar level of hyperactivation. In vitro capacitation properties were assessed flow cytometrically, as the decrease in membrane intact cells under capacitating conditions. No differences between Tyrode and Whittens capacitation medium were found, irrespective of the absence or presence of procaine.
Ergebnisse
4.2.2. Introduction
In vitro fertilization (IVF) in horse breeding is troublesome (Alm et al., 2001;
Choi et al., 1994; Dell’Aquila et al., 1996, 1997a, 1997b; Zhang et al., 1990; Hinrichs et al., 2002). Up to now, there are reports on only two foals which have been produced using IVF (Palmer et al., 1991; Bezard et al., 1992). Whereas IVF is successful in human reproduction and used commercially in the production of offspring of valuable cows, it is thought that unsuccessful in vitro induction of capacitation is the reason for the low success rates of in vitro fertilization in equine reproduction. The major barrier to IVF in the horse appears to be the penetration of the zona pellucida. Fertilization rates can be increased by partial or total removal of the zona or zona drilling, which in turn often results in polyspermy (Choi et al., 1994).
The term capacitation refers to the changes that ejaculated sperm undergo during maturation inside the female reproductive tract. Capacitation involves cellular events by which sperm acquire properties that allow for binding the zona pellucida and fertilizing an oocyte (for review see Yanagimachi, 1994). Changes include membrane modifications including changes in lipid composition and cholesterol efflux, reorganization of membrane proteins, changes in surface properties and fluidity, and permeability to calcium. Capacitated sperm become hyperactivated, which involves a change in the sperm motility pattern to high-amplitude, asymmetrical flagellar bends. Such movements help sperm to detach from the oviductal epithelium, to navigate through the twisting lumen of the oviduct and penetrate the zona pellucida (for review see Suarez, 2008).
Ergebnisse
Capacitation and hyperactivation are two processes that are prerequisites for successful fertilization. They require a capacitation medium supplemented with calcium (Baldi et al., 1991; Parrish et al., 1999; Ho & Suarez, 2003) and bicarbonate (Boatman & Robbins, 1991; Gadella & Harrisson 2000; Flesch et al., 2001). In addition, both processes involve cAMP synthesis (Gadella & Harrisson, 2002; Hess et al., 2005; Xie et al., 2006). The underlying molecular pathways involved in regulating capacitation and hyperactivation are poorly understood, but seem to be independent of each other (for review see Suarez, 2008).
For equine IVF a diversity of treatments and incubating conditions has been tested. Tyrode (Parrish et al., 1988) and a modified Whittens capacitation medium (McPartlin et al., 2008) are the media that are generally used for inducing in vitro capacitation of stallion sperm. Procaine, which is also used as a local anaesthetic, is reported to induce hyperactivation in sperm from different mammalian species (Marquez and Suarez, 2004, Mujica et al., 1994, Chang and Suarez, 2011), including stallion (McPartlin et al., 2009). It is though that procaine functions through increasing the permeability of the plasma membrane for calcium (Mujica et al., 1994). They found, however, an increase in ATP and cAMP levels in procaine-treated sperm irrespective of the extracellular calcium concentration. For stallion procaine-induced sperm hyperactivation was not associated with changes in protein tyrosine phosphorylation or the induction of acrosomal exocytosis (McPartlin et al., 2009).
McPartlin et al. (2008, 2009) have reported 60.7 % fertilized oocytes for equine IVF, when using procaine-induced hyperactivation and Whittens capacitation medium.
In a previous study we tested the use of procaine pentoxifylline and trolox, for their abilities to induce capacitation and hyperactivation of stallion sperm. In vitro
Ergebnisse
capacitation could only be induced in capacitation medium. Only use of procaine resulted in hyperactivation, irrespective of the medium used (Ortgies et al 2011).
The aim of this study was to analyze variation in procaine-induced hyperactivation and in vitro capacitation properties of sperm from individual stallions.
Sperm hyperactivation was induced using increasing procaine concentrations and analyzed using computer assisted sperm analysis. In vitro capacitation was evaluated by flow cytometric analysis of plasma and acrosomal membrane integrity upon exposure to (non-)capacitating conditions. The use of two types of capacitating medium (Tyrode and Whittens) was compared. Hyperactivation was induced under capacitating as well as non-capacitating conditions, to evaluate if hyperactivation and in vitro capacitation are coupled processes. Furthermore, it was tested if cryopreserved sperm responded to procaine in a similar fashion as diluted sperm.
4.2.3. Materials and methods
4.2.3.1. Semen collection and dilution
Semen was collected from stallions of the Hanoverian warmblood breed, which were held at the National Stud of Lower Saxony in Celle, Germany. The horses were kept in box stalls bedded with straw, were fed oats and hay three times a day, and water was freely available. Semen was collected from October to March.
Three ejaculates from each of six stallions aged 4 to 19 years were used. Semen was collected using an artificial vagina (Model Hanover, Minitube, Tiefenbach,
Ergebnisse
Germany). A breeding phantom was used, and a mare was fixed in front of the breeding phantom. Sterile gauze filtration was performed to remove the gel portion.
Semen was evaluated for volume, cell concentration and motility, after which it was diluted with pre-warmed skim milk extender (INRA-82; Vidament et al., 2000) at 100 x 106 cells mL-1 and stored at room temperature until use. INRA-82 was prepared by mixing equal amounts of glucose-saline solution and ultra heat treated skim milk. It consists of: 25 g L-1 glucose monohydrate, 1.5 g L-1 lactose monohydrate, 1.5 g L-1 raffinose pentahydrate, 0.4 g L-1 potassium citrate monohydrate, 0.3 g L-1 sodium citrate dihydrate, 4.76 g HEPES, pH 7.0, 500 mg L-1 penicillin, 500 mg L-1 gentamycin, 0.15% skim milk.
Cryopreservation of semen was performed as previously described (Sieme et al., 2003). In short, extended semen was centrifuged for 10 min at 600 x g after which the sperm cell pellet was resuspended in skim milk extender supplemented with 2.5% clarified egg yolk and glycerol, resulting in final concentrations of 2%
glycerol and 400 x 106 cells mL-1. This suspension was cooled to 5 ˚C during 2 h, after which it was packaged in 0.5 mL straws, cooled down to -140 ˚C at 60 ˚C min-1 and stored in liquid nitrogen. Thawing of straws was done in a water bath of 37 ˚C for 30 s, prior to analysis.
4.2.3.2. Flow cytometric analysis of in vitro capacitation
For in vitro capacitation assays, sperm were incubated in Tyrode medium (Parrish et al., 1988). Alternatively, Whittens medium was used (McPartlin et al., 2008). Tyrode A capacitation medium is composed of: 100 mM NaCl, 3.1 mM KCl,
Ergebnisse
2.0 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 0.3 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 21.6 mM Na- lactate, 1.0 mM Na-pyruvate, 10 mM HEPES, pH 7.5, 3 g L-1 BSA, and 50 µg mL-1 gentamycin. Tyrode B control medium (for non-capacitating conditions) lacked CaCl2, NaHCO3 and BSA, and was supplemented with 1 mM Na2EGTA. Whittens A medium is composed of 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5.5 mM glucose, 22 mM HEPES, 4.8 mM Ca-lactate and 1.0 mM pyruvic acid Na-pyruvate, 25 mM NaHCO3
and 7 mg mL-1 BSA. Whittens B control medium (for non-capacitating conditions) lacked NaHCO3 and BSA.
Incubations in Tyrode or Whittens A and B medium were done for 2 h, in medium equilibrated at 37 ˚C in the presence and absence of 5% CO2, respectively.
Sperm were diluted in Tyrode or Whittens medium at 1 x 106 cells mL-1. This was done by diluting 5 µL 100 x 106 cells mL-1 in skim milk extender in a final volume of 500 µL Tyrode or Whittens medium. Aliquots were prepared for evaluation of capacitation characteristics at subsequent time points. Fluorescent dyes were added to these aliquots 10 min prior to flow cytometric analysis.
For determination of percentages of sperm that have damaged plasma and acrosomal membranes, a double staining with propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and fluorescein labeled peanut agglutinin (FITC-PNA; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) was performed (Rathi et al., 2001). For PI/FITC- PNA staining, 5 µL 100 x 106 cells mL-1 in extender was diluted in 490 µL Tyrode or Whittens medium, and 2 µL 0.75 mM PI and 3 µL 75 µM FITC-PNA were added;
resulting in 1 x 106 cells mL-1, 3 µM PI and 0.45 µM FITC-PNA.
A flow cytometer (Cell Lab Quanta SC MPL; Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA) was used that is equipped with a 488 nm argon ion laser of 22 mw for
Ergebnisse
excitation, and BP 525/30, BP 590/30 and LP 670 nm filters for green, orange and red fluorescence, respectively. HEPES-buffered saline solution of 300 mOsm kg-1 (HBS; 20 mM HEPES pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM glucose, 2.5 mM KOH) was used as sheath fluid. A sheath fluid rate of approximately 30 µL min-1 was used resulting in 200 to 500 counts per second. A total of 5000 sperm were measured, that were selected on the basis of electronic volume and side scatter properties.
4.2.3.3. Procaine-induced hyperactivation
For tests in which hyperactivation was induced using increasing concentrations of procaine, extended sperm was centrifuged for 10 min at 600 x g, after which the cell pellet was resuspended in Tyrode A capacitation medium at 25 x 106 cells mL-1. Aliquots of 500 µL were prepared to which 100x procaine stock solution was added, resulting in final concentrations of 0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, and 8.0 mM procaine. Samples were incubated at 37 ˚C in the presence of 5% CO2 for 10 min.
For induction of hyperactivation via procaine on cryopreserved sperm;
cryopreserved samples were thawed for 30 s at 37 ˚C, and then diluted with Tyrode A to 25-50 x 106 cells mL-1 (8 times dilution: 1 part 400 x 106 cells mL-1 in INRA-82 supplemented with 2% egg yolk and 2% glycerol, 7 parts Tyrode A). Aliquots of 500 µL were prepared to which procaine stock solution was added as described above.
Computer assisted sperm analysis (CASA) was used to determine the effects of various concentrations of procaine on motility parameters. Parameters included:
total motile sperm (MOT, %), progressively motile sperm (PMS, %), curved line
Ergebnisse
velocity (VCL, µm s-1), and amplitude of lateral head displacement (ALH, µm). This was done using ‘Spermvision’ (Minitube, Tiefenbach, Germany), as previously described (Ortgies et al. 2011). Chambers of 20 µm (Leja, Nieuw Vennep, Netherlands) were loaded with an approximately 3 µL sample and maintained at 37
˚C. Ten microscopic fields were analyzed per sample, with 60 frames per second, for which averages were calculated.
Ergebnisse
4.2.4. Results
4.2.4.1. Procaine-induced hyperactivation
Figure 1 illustrates changes in sperm motility parameters for sperm incubated for 10 min in capacitating Tyrode medium supplemented with increasing concentrations of procaine. Whereas total motility was not affected by increasing concentrations of procaine, the percentage of progressively motile sperm decreased (figure 1A). Moreover, with increasing procaine concentrations, the beat cross frequency (BCF) decreased, while the amplitude of lateral head movement (ALH) increased (figure 1B), and the straight line velocity (VSL) and distance (DSL) decreased. The curve line velocity (VCL) and distance exhibited an optimum at 2.5 to 5mM procaine (figure 1C and 1D). The curve line velocity and distance as well as head movement were chosen as most pronounced parameters indicating hyperactivation.
4.2.4.2. Individual variation in procaine-induced hyperactivation and in vitro capacitation properties
In order to evaluate if sperm from individual stallions exhibited differences in procaine-induced hyperactivation and in vitro capacitation properties, averages for these processes were determined for three ejacualates from each of six stallions (figures 2 and 3). For procaine-induced hyperactivation, differences in the procaine concentration needed for maximum curve line velocities were seen amongst different
Ergebnisse
stallions: at 2.5 versus 5 mM, resulting in VCL values ranging from 180 to 240 µm s-1 (figure 2).
Also, in vitro capacitation properties were different for sperm from these stallions.
First of all, ejaculates from different stallions exhibited different numbers of plasma and acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA negative; closed black squares). Furthermore, upon incubation in Tyrode A capacitation medium, differences in the extent by which the number of membrane intact cells decreased were seen, indicating differences amongst stallions in capability to undergo in vitro capacitation. For example, stallion H1 (figure 3A) exhibits a decrease from 75% to 30% membrane intact cells, whereas stallion H5 (figure 3D) only decreases down to 45%.
4.2.4.3. Hyperactivation and in vitro capacitation properties in (non-) capacitation medium supplemented with procaine
In figure 4, the average response of sperm incubated in Tyrode A capacitating medium in compared with that of sperm incubated in Tyrode B control medium This clearly illustrates that sperm undergo in vitro capacitation in Tyrode A capacitation medium, but not in Tyrode B control medium, as is evident from the decrease in the percentages of plasma and acrosomal membrane intact cells upon exposure to (non- ) capacitating conditions. Incubation in Tyrode B control medium only results in a small decrease of only 5% in membrane intact cells during a 90 min incubation at 38
oC, whereas membranes become damaged for half of the sperm population upon incubation in Tyrode A capacitation medium for 60 min. Incubation in Whittens A
Ergebnisse
capacitation and Whittens B control medium gives similar results as Tyrode based media (figure 5A and 5C).
It was tested if addition of procaine to (non-)capacitating Whittens medium affected in vitro capacitation properties. Figure 5 illustrates that in vitro capacitation properties are unaffected by the presence of procaine, both in capacitating Whittens and control medium.
In contrast, hyperactivation could be induced both in capacitation and control medium. This is evident as higher VCL and ALH values for sperm incubated for up to 90 min in Whittens capacitation as well as control medium supplemented with 5 mM procaine (figure 6).
4.2.4.4. Procaine-induced hyperactivation of cryopreserved stallion sperm
It was tested if cryopreserved sperm responded to increasing procaine concentrations in a similar fashion as diluted sperm. Figure 7 shows changes in sperm motility parameters for cryopreserved sperm that was diluted with Tyrode A medium supplemented with increasing concentrations of procaine after thawing. It seems that a higher procaine concentration is required for cryopreserved sperm for attaining a similar increase in curve line velocity as diluted sperm (8 mM instead of 5 mM for a VCL of about 200 µm s-1).
Ergebnisse
4.2.5. Discussion
In the present study is described that procaine can induce hyperactivation, both in capacitating and non-capacitating medium, whereas in vitro capacitation properties are not affected by procaine. Capacitation and hyperactivation are are processes that are often suggested to be linked and dependent on each other since they are both required for fertilization. There are, however, reports that hyperactivation and capacitation can be induced separately, and they involve independent signaling pathways (for review see Suarez, 2008). The results described in this study are in agreement with this. Marquez & Suarez (2004) describe the use of pharmacological agents to induce hyperactivation of uncapacitated bovine sperm.
They, however, found that hyperactivation could not be induced under capacitating conditions that support acrosomal exocytosis. We found that induction of hyperactivation is also possible for cryopreserved sperm, although this requires higher concentrations of procaine
In the current study we found that in vitro capacitation of stallion sperm followed a similar pattern in Tyrode and modified Whittens capacitation medium.
McPartlin et al (2008) reported that modified Whittens medium was most successful in inducing in vitro capacitation in equine spermatozoa. When a procaine-induced hyperactivation was performed in this medium, they obtained 60.7% fertilized oozytes for use in equine IVF (McPartlin et al., 2008, 2009).
Procaine-induced sperm hyperactivation is evident as a star-shaped motility pattern using computer assisted sperm analysis sperm can be classified as hyperactivated objectively. We observed a dose-dependent change in motility
