Welche Rolle spielen die Histidin-Reste in der „Variablen Region“ im ZupT-vermittelten Metall-

sind. Dabei scheint nicht nur die Ladung dieser Aminosäuren eine wichtige Rolle für den Transport zu spielen. Interessant sind daneben der Serin-Rest an Position 117, der Glutamat-Rest an Position 60 und 152, die nicht nur für den Metall-Transport notwendig zu sein scheinen, sondern auch vermutlich zur Substratspezifität beitragen. Wie schon in Rogers et. al. (2000) vermutet, könnten TMH IV und V einen Kanal bilden, wobei die Substratbindung während des Metall-Transportes durch diese exponierten Aminosäuren erfolgen könnte. Für den

In S. cerevisae wird diese Funktion nicht durch die Histidin-Reste in der „Variable Region“ von ZRT1 vermittelt. Eine Mutation dieser Aminosäure-Reste führte lediglich zu einer verminderten maximalen Reaktionsgeschwindigkeit des Zink-Transportes. Die posttranslationale Inaktivierung von ZRT1 als schnelle Antwort auf das Vorhandensein hoher Zink-Konzentrationen im Cytoplasma wird durch eine potentielle metal response domain (MRD) vermittelt (Gitan et al., 2003). Dieses Sequenzmotiv (DATSMDV) ist neben der histidinreichen Sequenz im cytoplas-matischen loop lokalisiert. Wie jedoch der Abbau durch diese Sequenz vermittelt wird, ist bisher noch unklar. Dabei könnte eine Zink-Bindung an der MRD oder auch die Interaktion mit einem cytosolischen Protein die Ubiquitinierung und somit den Abbau von ZRT1 induzieren.

Abgeleitet von diesen Ergebnissen wird die Regulation der Expression von IRT1 aus A. thaliana von mehreren Autoren diskutiert. Es ist bekannt, dass unter Eisen-Mangelbedingungen die Expression von IRT1 induziert wird, dabei übernimmt FIT (FER-like iron deficiency-induced transcription factor) eine Schlüsselfunktion (Colangelo und Guerinot, 2004; Bauer et al., 2007).

Wie jedoch eine schnelle Antwort auf Eisen-Überschuss erfolgt, ist bisher unbekannt. Dabei wird ebenso eine Beteiligung der Histidin-Reste in der „Variablen Region“ in Betracht gezogen. Durch Isothermale Titrationskalorimetrie wurde die Affinität verschiedener Metalle zu einem künstlichen Peptid bestimmt, dessen Aminosäure-Sequenz identisch mit der der „Variablen Region“ war. Die Autoren zeigen, dass diese histidinreiche Region sehr niedrige Bindungs-Affinitäten zu den typischen IRT1-Substraten, außer zu Fe(III), aufweist (Grossoehme et al., 2006). Folglich wird vermutet, dass die Bindung von intrazellulärem Fe(III) einen Eisen-Überschuss signalisiert und somit die Eisen-Aufnahme indirekt reguliert werden könnte (Grossoehme et al., 2006).

Vermutlich übernimmt die „Variable Region“ in verschiedenen ZIP-Transportern verschiedene Funktionen. So scheint in Eukaryoten die histidinreiche Region zum einen in der posttrans-lationalen Regulation des ZIP-Transportes und zum anderen im Metall-Transport an sich involviert zu sein. Welche Funktion könnte jedoch die histidinreiche Region in Prokaryoten übernehmen; eine regulatorische oder funktionelle?

Zum jetzigen Zeitpunkt ist ZupT als einziger bakterieller Vertreter der ZIP-Familie charakterisiert worden. Ein weiterer putativer bakterieller ZIP-Transporter wurde kürzlich im Cyanobakterium Nostoc punctiforme durch Genom-Analysen identifiziert (Hudek et al., 2009). Im metall-resistenten Bakterium Cupriavidus metallidurans existiert ebenfalls ein putativer ZIP-Transporter (Voigt, 2008; Scherer, persönl. Mitteilung). Im Gegensatz zu zupT aus E. coli erfolgt die Gen-expression dieser ZIP-Transporter nicht konstitutiv, sondern wird je nach Metall-Verfügbarkeit reguliert (Hudek et al., 2009; Voigt, 2008; Scherer, persönl. Mitteilung). Vergleicht man die AS-Sequenzen dieser bakteriellen ZIP-Transporter, so stellt man fest, dass in der „Variablen Region“

vom ZIP-Transporter aus C. metallidurans CH34 sehr viele Histidin-Reste vorhanden sind, wohingegen die beiden anderen ZIP-Transporter, aus E. coli und N. punctiforme, nur sehr wenige Histidin-Reste in dieser Region aufweisen (Abb. 33).

C. metallidurans CH34 EKISLLRHSHHHEGDGHHHHHGHDREEA E. coli DRM----LPHAHPQDLMQKSVQPLPKSI N. punctiforme NWFLSYQGAKHRKRSGEQQ---PSEEEN : : .: : . :: :.

Abb. 33: Sequenz-Alignment der „Variablen Region“ der bakteriellen ZIP-Transporter

Dargestellt ist ein Alignment der „Variablen Region“ der bakteriellen ZIP-Transporter aus C. metallidurans, E. coli und N. punctiforme. Identische (*) und ähnliche (. und :) AS sind unterhalb der Sequenz gekennzeichnet. Fett sind die Histidin-Reste des cytoplasmatischen loops bzw. der „Variablen Region“ gekennzeichnet.

Aufgrund des sehr geringen Konservierungsgrades der Aminosäuren in der „Variablen Region“

innerhalb der bakteriellen ZIP-Transporter liegt die Vermutung nahe, dass die Anzahl der Histidin-Reste eine spezifische Anpassung je nach Bakterium sein könnten. C. metallidurans besitzt, im Gegensatz zu E. coli, kein weiteres Zink-Aufnahme-System wie z. B. das hochaffine ZnuABC-System (Patzer und Hantke, 1998). ZupT scheint das essenzielle Zink-Aufnahme-ZnuABC-System in C. metallidurans darzustellen (Voigt, 2008; Scherer, persönl. Mitteilung), sodass der Zink-Transport, genau den Milieubedingungen entsprechend, reguliert werden muss. Somit ist es von enormer Bedeutung, den Metall-Einstrom schnellstmöglich zu kontrollieren. So könnte eine Metall-Bindung an die Histidin-Reste in der „Variablen Region“ ein indirekter Hinweis für die Verfügbarkeit im Cytoplasma darstellen. Sind die Bindungen besetzt, so ist der Metall-Transport schnell gesättigt und der Metall-Einstrom wird verringert. Auf diese Art und Weise könnte indirekt der Metall-Transport als solches in C. metallidurans reguliert werden.

Dagegen ist sowohl in E. coli als auch in N. punctiforme das hochaffine Zink-Aufnahme-System ZnuABC vorhanden und sichert somit die Zink-Versorgung. In der „Variablen Region“ des ZIP-Transporters aus N. punctiforme ist lediglich ein Histidin-Rest vorhanden. Dennoch ist dieser ZIP-Transporter vermutlich in der Lage, Zink zu transportieren. In ZupT aus E. coli sind zwei Histidin-Reste in der „Variablen Region“ vorhanden. Ein Austausch jeweils beider Histidin-Histidin-Reste in Arginin veränderte nicht die Transport-Eigenschaft von ZupT (Tab. 5). Wurde jedoch das Histidin an Position 87 im ZupT-Protein gegen ein Alanin ausgetauscht, konnte diese Mutante nicht mehr in der Membran nachgewiesen werden. In Wachstums-Endpunktbestimmungen konnte dagegen sogar eine gesteigerte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Protein beobachtet werden. Vermutlich wurde durch die Überexpression dieser ZupT-Mutanten ein zu hoher Metall-Einstrom bewirkt und dadurch dieses Mutanten-Protein abgebaut. Wurde jedoch das zweite Histidin an Position 89 gegen ein Alanin ausgetauscht, so konnte durch diese ZupT-Mutante kein Cobalt und Eisen transportiert werden, der Zink- und Mangan-Transport wurde ebenfalls beeinträchtigt. Die Isotopen-Aufnahmeexperimente zeigten dagegen Wildtyp-Transporteigenschaften hinsichtlich dieser Metalle, jedoch lassen sich aus den Aufnahmeexperimenten keine Rückschlüsse auf einen veränderten Km-Wert oder einer veränderten maximalen Reaktionsgeschwindigkeit ziehen. Das Histidin an Position 89 ist, im Gegensatz zum Histidin an Position 87 im ZupT-Protein, essenziell für den Cobalt-, Eisen- und Zink-Transport. Jedoch scheint der Imidazol-Ring dieser Aminosäure nicht für den Metall-Transport notwendig zu sein, denn ein Arginin an dieser Position ermöglichte

ebenfalls einen Metall-Transport. Dennoch lässt sich zusammenfassend sagen, dass das Histidin an Position 87 im ZupT-Protein wichtig für die Substratspezifität sein könnte und eher regulatorische Funktion übernehmen könnte.

4.2. Das Zusammenspiel von Eisen-und Mangan-Homöostase in einer